Микробиология

131

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом дисков (диффузии в агар)

1.На чашку с подсушенной плотной питательной средой нанести0,1 мл

стандартной жидкой культуры .Еcoli М-17 (или любой другой исследуемой культуры), содержащей 1·109 микробных клеток/мл по оптическому стандарту мутности, и равномерно распределить шпателем по всей поверхности среды.

2.Дать впитаться посевному материалу (подсохнуть засеянной поверхности среды) в течение 5-10 мин

3.На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного анализируемой культурой, стерильным пинцетом наносят бумажные диски, пропитанные разными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5-6 дисков). Диски для тесного контакта со средой плотно накладывают на поверхность агара, следя за тем, чтобы не были положены два сцепленных между собой диска. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и на расстоянии 2-1,5 см от края чашки.

4.Чашки ставят в термостат при 37°С в течение суток. Если исследуемый микроорганизм растет медленно, то учет производят через48 -72 ч инкубации или позже в зависимости от появления роста газона.

5.Оценка результатов. После соответствующей инкубации поверхность агара, которая вначале была полупрозрачной, мутнеет из-за рассеяния света выросшими бактериями. Полупрозрачные зоны остаются лишь только вокруг дисков с антибиотиками, поскольку антибиотик диффундирует в агар и подавляет рост бактерий.

С помощью линейки или измерителя и миллиметровой бумаги определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до10 мм штамм расценивается как малочувствительный. Зона задержки роста микроба более10 мм указывает на чувствительность штамма к антибактериальному препарату. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику.

Если использовались диски, пропитанные растворами с различными концентрациями одного и того же антибактериального препарата, а диаметр зон задержки роста определялся в строго стандартных условиях, то размер зон будет функцией логарифма концентрации антибиотика. Используя известные концентрации антибиотика, строят стандартную кривую, по которой можно определить концентрацию антибиотика в неизвестных растворах.

6.На занятии теоретически с преподавателем рассмотреть другие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

132

Лабораторная работа № 3.3.

Определение антагонистической активности микроорганизмов. Бактериоциногения. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

1.Общие сведения

1.1.Антагонистическая активность микроорганизмов.

Бактериоциногения

В природных условиях различные виды микроорганизмов живут ассовциациях, оказывая друг на друга взаимное влияние, зависящее как от свойств микроорганизма, так и от окружающих условий. Одной из форм взаимодействия микробов, является антагонизм - угнетающее влияние одного микробного вида на другой; оно выражается в задержке развития или гибели микроорганизмов, на которых, микроб-антагонист оказывает свое действие.

Антагонизм наблюдается среди многочисленных групп микробов и в настоящее время широко используется в медицинской практике в виде применения антибиотиков (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов-антагонистов) для лечения и профилактики инфекционных болезней. Весьма активные антагонисты обнаруживаются в воде, воздухе, почве.

Способность некоторых штаммов бактерий продуцировать специфические антибиотические веществабактериоцины, подавляющие жизнедеятельность бактериальных клеток других штаммов того же вида или филогенетически родственных видов, называется бактериоциногенией.

Бактериоциногения обнаружена у многих видов бактерий. Большая группа нехромосомных генетических элементовплазмид детерминирует и контролирует синтез бактериоциноз разных видов бактерий. Бактериоцины именуются, как правило, в соответствии с видовым названием продуцентов. Бактериоцины обнаружены у кишечных палочек(колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины), синегнойных палочек (пиоцины) и др. В соответствии с этим способность отдельных видов бактерий продуцировать бактериоцины называется колициногенией(пестициногенией и т.д.).

Наиболее изучены колицины, продуцируемые кишечными палочками, шигеллами и некоторыми другими видами энтеробактерий. Бактериоцины одного

итого же вида могут различаться по ряду признаков и в связи с этим подразделяются на типы. Колицины энтеробактерий (продуцируемые под контролем колициногенных плазмид) представляют собой вещества белковой природы. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физико-химическим

иантигенным свойствам и по способности адсорбироваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Они обозначаются латинскими бу-

квами А, В, С, D, Е1, E2, К и т.д.

Чувствительность или устойчивость бактериальных клеток действиюк бактериоцинов определяется прежде всего наличием или отсутствием на их -по верхности рецепторных структур, специфически адсорбирующих тот или иной

133

бактериоцин. Из популяции чувствительных к бактериоцину бактерий могут быть выделены особи, утратившие вследствие мутации способность синтезировать рецепторные структуры и ставшие в связи с этим устойчивыми к бактериоцину соответствующего типа. Такие устойчивые мутанты часто сохраняют чувствительность к другим бактериоцинам того же вида. Следовательно, бактериоцины одного и того же вида могут различаться по специфичности адсорбции на рецепторных структурах бактериальных клеток. Это свойство используется для типирования ряда колицинов.

Бактериоциногенные бактерии, кроме способности продуцировать бактериоцин, характеризуются еще одной отличительной особенностью: они устойчивы к действию продуцируемого ими бактериоцина, хотя и обладают рецепторными структурами, адсорбирующими данный бактериоцин. Такая устойчивость, в отличие от устойчивости бактериоциногенных клеток, утративших соответствующие рецепторы вследствие мутации, называется иммунитетом бактериоци-

ногенных бактерий к гомологичному бактериоцину.

В некоторых случаях равные типы бактериоцинов, адсорбирующихся на одних и тех же рецепторах, можно дифференцировать на основании иммунитета клеток, продуцирующих эти бактериоцины. Так, колицины группы Е, адсорбирующиеся на одних и тех же рецепторах, делятся по специфичности иммунитета на типы Е1, Е2, ЕЗ, Е4. Бактерии, продуцирующие один из типов колицинов группы Е, иммунны к данному колицину, но сохраняют чувствительность к другим колицинам этой группы. Деление колицинов группы Е по специфичности иммунитета продуцирующих их клеток полностью соответствует их делению по антигенной специфичности. Например, сыворотка против колицина E2 нейтрализует колицины этого типа, но не оказывает никакого влияния на активность колицинов типов Е1, ЕЗ, Е4.

При обычных условиях культивирования в большинстве клеток бактериальной популяции, содержащей колициногенные особи, синтеза колицина не происходит. Примерно в одной из1000 клеток отмечается так называемая продукция колицина. Однако количество колицинпроду-цирующих клеток может быть резко увеличено при обработке бактерий УФ-лучами или некоторыми другими агентами,, выступающими в качестве индукторов. При этом погибают только клетки, продуцирующие колицины. В то же время бактериальные клетки, несущие Col-плазмиды, резистентны к действию гомологичного колицина так же, как и лизогенные бактерии к действию гомологичного фага. Таким образом, характерной чертой Col-плазмид является потенциальная летальность для клетокпродуцентов, которая сближает их с профагами.

Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. Показано, что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (Е3) нарушает функцию рибосом, другой (Е2) является ферментом - эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембрану бактерий.

Колициногенные (Col) плазмиды находятся в клетках энтеробакте-рий в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой. Однако некоторые из них(Col V, Col В) могут встраиваться в бактериаль-

134

ную хромосому и находиться в ней в интегрированном состоянии. Они, так же как и F-плазмиды, передаются путем конъюгации в рецепиентные клетки, благодаря имеющемуся у них tra-оперону.

Широкое распространение бактериоциногении среди микрофлоры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влияющих на формирование природных биоценозов. Вместе с тем колицины, продуцируемые кишечной палочкой - нормальным обитателем кишечника, могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, попавшие в кишечник, способствуя тем самым нормализации его естественного микробиоценоза.

Способность продуцировать различные типы колицинов используется для титрования бактерий с целью эпидемиологического анализа вызываемых ими заболеваний. Такое типирование осуществляется путем определения типаColплазмиды (колициногенотипирование) или типа колицина, образуемого бактериями (колицинотипирование), выделенными от больных или из окружающей среды.

1.2. Фаготипирование бактерий. Определение лизогении Бактериофаги - вирусы бактерий (т.е. вирусы, способные инфицировать

бактериальную клетку, репродуцироваться в ней, образуя многочисленное потомство, и вызывать еелизис, сопровождающийся выходом фаговых частиц в среду обитания бактерии). Вирусы бактерий (фаги), или бактериофаги, широко распространены в окружающей средеводоемах, почве. Фаги кишечных бактерий - кишечной палочки, шигелл, сальмонелл - могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Стафилофаги обнаруживаются в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, в почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему бактерий.

Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают инфекцию, заражение ими бактерий всегда завершается лизисом клетки и освобождением в среду фагового потомства. Для умеренных же фагов существуют два альтернативных цикла развития - лизис клетки, как при заражении вирулентным фагом, или же установление особого типа симбиотического взаимоотношения с клеткой, которое сохраняется при последующем делении бактерии и передается ее потомкам. Это состояние, как правило, обусловлено включением нуклеиновой кислоты умеренного фага в хромосому бактерии, с которой она реплицируется, Бактерии, несущие умеренный фаг, называются лизогенными, а форма бактериофага, присутствующая в лизогенной бактерии, - профагом.

Большинство фагов имеетсперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка (рис. 1). У некоторых фагов отросток очень короткий или вовсе отсутствует. Размеры фаговой частицы колеблются от 20 от 200 нм. Средний диаметр головки равен60-100 нм, длина отростка 100-200 нм.

135

Рис. 1 Бактериофаг (схема строения и электронная микрофотография

частиц фага α и бактерии B.coli, зараженной этим фагом)

Различают несколько морфологических типов бактериофагов (рис.2).

Рис.2 - Морфологические типы бактериофагов. Объяснение в тексте

136

К I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют клетки бактерий, несущих F-плазмиду. II тип составляют фаги с аналогом отростка. Это мелкие РНК-содержащие фаги и однонитевой ДНК-фагyХ174. К III

типу относятся фаги Т, Т с коротким отростком. К IV типу - фаги с несокра-

3 7

щающимся чехлом отростка и двунитевой ДНК(T1,.T5). V тип представляют ДНК-содержащие фаги с сокращающимся чехлом отростка, заканчивающимся базальной пластинкой равной формы (Т2, Т4, Т6).

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФ-азы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе "прокалывания" клеточной стенки принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток остаются вне клетки).

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливаются десятки и сотни новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30-40 минут. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами(типами) данного вида бактерий.

Лизогения

Наряду с описанным выше продуктивным типом взаимодействия - бак териофагов с прокариотическими клетками, заканчивающегося лизисом бактерий, взаимодействие может проходить по интегративному типу. В отличие от вирулентных фагов, умеренные бактериофаги встраивают свою ДНК вбактериальный геном, переходя в состояние профага, бактериальные клетки при этом становятся лизогенными. Само явление лизогенизации бактерий называется лизогенией. Это название отражает потенциальную способность лизогенных бактерий к

137

лизису при освобождении профага из состава бактериального генома и перехода в вирулентный фаг, способный репродуцироваться (рис.3).

Фаг l

Потомство

Рис.3 - Продуктивная фаговая инфекция и лизогенизация бактерий (интегративная инфекция)

Спонтанный лизис нередко происходит в отдельных клетках популяции лизогенных бактерий, но не захватывает все клетки. Это связано со способностью лизогенных бактерий приобретать иммунитет к последующему заражению одноименным фагом, вследствие чего остальные лизогенные клетки, содержащиеся в бактериальной популяции, полностью сохраняют свою целостность и жизнеспособность.

Продукция фагов лизогенными бактериями значительно увеличивается при их облучении суббактерицидными дозами УФ-лучей или при обработке -не которыми химическими соединениями, взаимодействующими с их ДНК. Данный феномен называется индукцией профага.

Лизогенные культуры могут приобретать дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизма под влиянием профага получило названиефаговой или лизогенной конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносить эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка при этом станет лизогенной, то она приобретает новые свойства, что позволяет говорить об умеренных фагах как о мощном факторе изменчивости микроорганизмов.

138

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков и других биологических веществ, оказываются лизогенными, то существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо приведет к лизису производственного штамма.

2. Содержание лабораторного занятия Цели занятия:

-ознакомиться с основными методами определения антагонистической активности микроорганизмов;

-ознакомиться с основными методами определения бактериоциногенных факторов;

-освоить методы выделения бактериофага из исследуемого материала;

-освоить качественные пробы для обнаружения бактериофага в жидких и на плотных питательных средах;

-освоить методы титрования бактериофага;

-освоить метода фаготипирования бактерий;

-ознакомиться с методами определения лизогении.

Материалы и оборудование

Жидкие и плотные питательные среды(в пробирках, чашках Петри);

культуры бактерий (Proteus vulgaris, Sarоina flava, Esсherichia coli M-17, Salmonella enteritidis var.Isatchenco, Pseudomonas fluorescens, Lactobacillus plantarum);

бактериологическая петля; спиртовка; градуированные пипетки; Пастеровские пипетки; шпатель; набор бактериофагов; иллюстративный материал.

Ход работы

2.1. Методы выявления микробного антагонизма Метод 1. Чашку с мясо-пептонным агаром равномерно засевают шпате-

лем суточной бульонной культурой угнетаемого микроорганизма( пример, стафилококка). Затем ив чашки с агаром, предварительно засеянной антагонистом (например, актиномицетом), вырезают вместе с агаром колонию антагониста и накладывают на первую засеянную чашку(колонией кверху). Эту чашку ставят в термостат при температуре 37°С. Результат учитывается через сутки: образуется стерильная зона.

Метод 2. На чашку с мясо-пептонным агаром посередине широкой полосой засевают суточную бульонную культуру антагониста (например, E.coli М-17). Через сутки перпендикулярно к посеву вплотную подсевают суточную бульонную культуру угнетаемого микроба(стафилококк, энтеробактерии). Результат учитывают через сутки пребывания втермостате: рост угнетаемого микроба отступает от полосы, засеянной антагонистом.

139

2.2. Методы определения бактериоциногенных факторов Микробиологические методы аналогичны методам выявления микроб-

ного антагонизма и основана на формировании разного типа зон подавления на плотных питательных средах или снижении числа жизнеспособных клеток чувствительных (индикаторных) бактерий при совместном их культивировании или на устойчивости (чувствительности) к действию бактериоцина.

Генетические методы базируются на передаче трансмиссивных элементов от донора к реципиенту путем конъюгации или мобилизации нетрансмиссив-

ных элементов с использованием трансмиссивных плазмид.
Физико-химические	методы основаны	на	применении	физико-

химических приемов и методов при сравнительном анализе общей массы ДНК колициногенных и неколициногенных бактерий (бактериоциногенных и небактериоциногенных), а также на определении специфических структур ДНК, их молекулярного веса.

2.3. Выделение бактериофагов из патологического материала и объектов внешней среды

Фагу присущи резко выраженные паразитические свойства, обусловливающие возможность существования и размножения его только в культурах -со ответствующего вида микробов. На этом основании присутствие бактериофага можно рассматривать как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала соответствующей микрофлорой. Определенные фаги можно искать там, где обитают их хозяева - микробы.

Впрактике микробиологии обнаружение бактериофага производят в том случае, когда выделение культуры микробов не дает положительных результатов, например, вследствие чрезмерно малого количества этих микробов в исследуемом субстрате или сильного загрязнения его посторонней микрофлорой.

Внастоящее время разработаны различные методы качественного обнаружения фага в исследуемом материале. В основу всех методов положен феномен бактериофагии д'Эрелля, для проявления которого исследуемый материал засевают совместно с гомологической культурой микробов на плотные и жидкие питательные среды. Культуры микробов, чувствительные к выделяемому бактериофагу, принято называть тест-культурами.

Прямой метод выделения бактериофага из исследуемогоматериала. Ис-

следуемую жидкость фильтруют от микробов. Твердый исследуемый материал (образцы почвы, пищевые продукты, оформленные испражнения) предварительно измельчают в ступке, эмульгируют, фильтруют вначале через бумажный, а затем - через бактериальный фильтр. Наличие фага в полученном фильтрате определяют в жидких питательных средах по методу Отто или Грациа.

Выделение бактериофага методом обогащения "без подсева". Исследуе-

мый материал засевают в жидкую питательную среду, являющуюся наиболее полноценной для развития тех микроорганизмов, против которых ищут бактериофаг. Посевы ставят в термостат и инкубируют при оптимальной температуре 18-20 часов. По истечении указанного срока сосуды с посевами вынимают ив термостата и фильтруют предварительно через бумажный, а затем через бактери-

140

альный фильтр. Полученные фильтраты испытывают на присутствие в них бактериофага на плотных и жидких питательных средах. В основу этого метода положен принцип создания наиболее благоприятных условий для размножения находящихся в исследуемом материале бактерий и соответствующего им бактериофага, который предполагается выделить.

Выделение бактериофага методом обогащения "с подсевом". Жидкий ис-

следуемый материал непосредственно, а плотный - после предварительного измельчения в ступке засевают в мясо-пептонный бульон или другую жидкую питательную среду. Одновременно с исследуемым материалом в питательную среду вносят 0.5-1 мл суточной бульонной культуры бактерий, гомологичных выделяемому фагу, для контроля культуру бактерий, применяемую для обогащения, засевают в стерильную питательную среду.

Сосуды с посевами ставят в термостат при37°С на 18-24 часа. После инкубации из опытной и контрольной пробирок берут по несколько миллилитров жидкости и фильтруют отдельно через бактериальные фильтры. Полученный фильтрат исследуют на присутствие бактериофага, гомологичного бактериям, применяемым для обогащения.

Сущность данного метода заключается в предварительном обогащении исследуемого материла клетками того микроорганизма, к которому ищут бактериофаг. Бактерии, внесенные в исследуемый материал, начинают размножаться, и вместе с ними увеличивается количество фага.

Качественные пробы для обнаружения бактериофага в жидких и на плотных питательных средах

Обнаружение бактериофага вжидкой питательной среде. Два сосуда

(пробирки или колбы) с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичной к искомому фагу. Одновременно с посевом или после 3-4-часового инкубирования в термостате в один из сосудов вносят фильтрат исследуемого материала. Второй сосуд, содержащий питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Оба сосуда ставят в термостат при 37°С и через 24 часа учитывают результат.

При учете результатов (по Уварову) возможны следующие варианты:

1.Содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле - помутнение питательной среды. Полученные данные указывают на содержание в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности.

2.В опытном сосуде имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды. Это свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности,

3.При одинаковом помутнении в обоих сосудах для окончательного -за ключения об отсутствии бактериофага необходимо произвести дополнительное исследование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контрольной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после24 часов инкубирования при 37°С учитывают результаты. Посев из контрольного сосуда даст сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на