Микробиология

101

Рассеивать накопительную культуру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной среды проводят штрих в таком поряд, каке указано на рис. 2. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.

Рис.2 - Схема рассева культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды в чашках Петри бактериологической петлей

После посева чашки помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов.

Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной (полужидкой или жидкой) питательной среды в пробирках.

Изолированные колонии аэротолерантных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получаютметодом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по15-20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помешают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накопительной культуры в стерильном физиологическом растворе. Разведение готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0.5-1.0 мл разведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется плотностью накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки пламенем горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в чашки Петри. После того, как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает, сразу же гибели клеток, то посев проводят на поверхности среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат.

Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение накопительной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50°С агаризованной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведении. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают по-

102

верхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (соотношение 3:1), что препятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды

(рис.3).

Рис. 3 – Изолированные колонии анаэробных бактерий, полученные методом разведения

Иногда агаризованную питательную среду после посева и тщательного перемешивания переносят в сушильные трубки Бурристеклянные трубки длиной 20-25 см, диаметром 1.0-1.5 см. Трубки предварительно стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают этот конец также резиновой пробкой.

Для этих целей можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующие разведения накопительной культуры в -рас плавленной агаризованной питательной среде. Конец капилляра запаивают.

Рис.4 - Изолированные колонии облигатных анаэробов в пробирках, заполненных газом (по Хангейту); 1 - агаризованная среда, 2 - конденсат, 3 - смесь газов Н2 и СО2, 4 - колонии бактерий

103

При удачно выбранных разведениях накопительной культуры в одной из пробирок (трубок Пастера, пипеток Бурри) вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь образовавшиеся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стерильной иглой слой парафина и вазелинового масла, а столбик агаризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стеклянную чашку Петри, пропуская гав, не содержащий кислорода, через капилляр, который помещают между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

Иногда плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробирку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным скальпелем и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают пинцетом и участки капилляра, содержащего изолированные колонии, переносят в стерильную среду.

Когда хотят получить изолированные колонии облигатных анаэробных бактерий, характеризующихся особенной высокой чувствительностью к кислороду (экстремальные анаэробы), используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Сущность этого метода заключается в следующем. Расплавленную агаризованную среду заражают при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку. Агаризованная среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и -за стывает тонким слоем. Применение тонкого слоя агаризованной среды позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом

(рис.4).

Выделение чистой культуры из одной клетки

Чистую культуру из одной клетки можно выделить капельным методом, с помощью микроманипулятора или микроселектора.

Капельный метод Линдера используют при работе с крупными микроорганизмами: дрожжами, мицелиальными грибами, водорослями. Порядок работы следующий. Накопительную культуру разводят в стерильной питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильным стальным пером (микропипеткой) наносят ряд капель приготовленного разведения. Готовят препарат "висячая капля". Нанесенные на покровное стекло капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. После этого препарат помещают в термостат во влажную камеру, которой обычно служит чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне. Через 12-24 часа отмеченные капли вновь микроскопируют. Те капли, в которых наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стек-

104

ла кусочками стерильной фильтровальной бумаги и переносят в пробирки со стерильной средой.

Выявление отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Мик-

романипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом (рис.5). Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат"висячая капля".

В держателях операционных штативов закреплены микропипетки(микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью с помощью системы винтов и рычагов. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в "висячей капле", исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой.

Рис.5 - Микроманипулятор со скользящими плоскостями конструкции Рейнерта: 1 - нижняя пластина штатива, 2 - колонка, 3 - общая подставка для микроскопа и микроманипулятора, 4, 5 - скользящая пластина с рукояткой, 6 - штатив микроманипулятора для крепления держателя микроинструментов 7

Выделение отдельных клеток с помощью микроселектора Перфилье-

ва. Наиболее существенной частью микроселектора Перфильева является стеклянный микрокапилляр, имеющий строго прямоугольное сечение. Благодаря этому канал капилляра хорошо просматривается даже с иммерсионным объективом. Стерильный материал заполняют стерильной суспензией клеток в агаризованной питательной среде и при большом увеличении микроскопа находят участок с одной клеткой. Специальным приспособлением этот участок капилляра стерильно выбивают в приемник, из которого затем переносят в стерильную среду. Микроселектор Перфильева можно использовать для выделения как крупных, так и мелких микроорганизмов.

105

Определение чистоты выделенной культуры

Чистота выделенной культуры микроорганизмов должны быть тщательно проверена. Это осуществляется обычно несколькими способами-визуальным, микроскопическим контролем и высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной плотной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред. Чистоту культуры микроорганизмов обязательно нужно контролировать под микроскопом. Для этого следует приготовить препарат фиксированных окрашенных клеток и просмотреть его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и просмотреть его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура микроорганизмов, как правило, морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Однако необходимо помнить, что клетки некоторых бактерий(например, микобактерий, нокардий и др.) очень полиморфны, поэтому определение чистоты таких культур при микроскопировании вызывает некоторые затруднения.

Чистоту культур микроорганизмов обязательно проверять высевом на питательные среды. Прежде всего, выделенную культуру высевают на плотную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колонийсвидетельство чистоты культуры, Обязателен посев на мясо-пептонный агар(МПА) - среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или, напротив, отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо-пептонном агаре не развиваются. Следует иметь в виду, что заключение о чистоте некоторых культур нельзя сделать только по результатам высева наMIA. Особенно это касается автотрофных микроорганизмов, а также представителей гетеротрофов, склонных развиваться с одним или несколькими спутниками. Чистоту таких культур микроорганизмов проверяют высевом на ряд сред, состав которых определяется особенностями метаболизма выделенных микроорганизмов, а также их возможных спутников.

Культуральные (культурально-морфологические) свойства микроорганизмов при выращивании на плотных

ижидких питательных средах

Ккультуральным (культурально-морфологическим или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Будучи постоянными для каждого микроорганизма, они являются важным диагностическим признаком при идентификации микроба.

Рост микроорганизмов на плотной питательной среде. На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в тол-

ще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные или донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим раз-

106

нообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитывают следующие признаки: величину (размер), форму, поверхность, контур края, профиль (рельеф), блеск и прозрачность, структуру и консистенцию колонии.

Величина (размер) колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии точечные(диаметр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1-й мм), средние (диаметр 2-4 мм), крупные (диаметр более 4 мм).

Форма колонии бывает правильная - круглая, неправильная - амебовидная, ризоидная - корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев

(рис. 6).

Рис.6 - Форма колоний: 1 - круглая, 2 - круглая с фестончатым краем, 3 - круглая с валиком по краю, 4, 5 - ризоидная, 6 - с ризоидным краем, 7 - амебовидная, 8 - нитевидная, 9 - складчатая, 10 - неправильная,

11 - концентрическая, 12 - сложная

Профиль (рельеф) колонии характеризуется приподнятостью колонии над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяют рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматри-

вании сверху или сбоку. Различают: 1) каплевидные и куполообразные коло-

нии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпуклости, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса; колонии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса, куполообразные -меньшую; 2) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды; 3) колонии конусовидные, имеющие в вертикальном разрезе форму тре-

107

угольника; 4) колонии с вдавленным центром (кратерообразные); 5) колонии приподнятые в виде соска в середине и с валиком по периферии; 6) колонии, врастающие в субстрат; 7) колонии со сложным рельефом – бугристые, изо-

гнутые, плоско-выпуклые (трапециевидные) и т.п. (рис. 7).

Рис.7 - Профиль колонии: 1 – изогнутый, 2 – конусовидный, 3 – бугристый, 4 – врастающий в субстрат, 5 – плоский, 6 – выпуклый, 8 – конусовидный

Характер контура края колонии определяют при рассмотрении его под микроскопом с малым увеличением или под лупой. Различают ровные (гладкие) края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на: фестончатый, состоящий из крупных, слегка округлых или уплощенных зубцов правильной формы, волнистый, который отличается от фестончатых тем, что круп-

ные зубцы его выражены нечетко, зубчатый, реснитчатый, ветвистый, ворсинчатый и т.п. (рис. 8).

Рис. 8 - Край колонии: 1- гладкий, 2 - волнистый, 3 - зубчатый, 4 - лопастной, 5 - неправильный, 6 - реснитчатый, 7 - нитчатый, 8 - ворсинчатый, 9 - ветвистый

Структура колоний определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и колоний, не пропускающих света, она не определяется. По характеру структуры определяют следующие виды колоний: гиалиновые - бесцветные, прозрачные - без видимой определенной структуры, зернистые - в зависимости от величины верен разделяют на мелко- и крупнозернистые, струйчатые - похожи на завихрения струи воды, нитевидные (волокнистые) - характеризуются наличием переплетающихся нитей в толще колонии или по краям.

Структура колоний может быта однородной и неоднородной. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

108

Консистенцию колоний, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают: плотные, мягкие,

смолистые (вязкие) - прилипают и тянутся га петлей, волокнистые, кожистые,

пленчатые - снимаются с агара целиком, хрупкие, сухие - рассыпаются при прикосновении петли.

Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S, шероховатые - R. Механизм образования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колонияхS-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотио- и химиотерапии, факторов внешней среды и специфического иммунитета.

Прозрачность колонии определяют в проходящем свете. Колонии быва-

ют прозрачные, мутные, непрозрачные.

Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Подавляющее большинство патогенных бактерий не образует, вследствие чего их колонии мутные или молочно-белого цвета, похожие на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны, Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Рис.9 - Рост бактерий по штриху: 1 - сплошной с ровным краем, 2 - сплошной с волнистым краем, 3 - четкообразный, 4 - диффузный, 5 - перистый, 6 - ризоидный

Для описания характера роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный (рис. 9). Характеризуют оптические свойства газона, его цвет, поверхность и консистенцию.

Для описания колоний и роста по штриху хемоорганогетеротрофных микроорганизмы чаще всего выращивают на мясо-пептонном агаре(МПА). Для лучшего рассмотрения глубинных колоний среды с агаром или желатиной рекомендуется осветлять.

109

Рост микроорганизмов в жидких питательных средах. Рост микроорга-

низмов в жидких питательных средах менее разнообразен по характеристикам, чем на плотных питательных средах. Различают: 1/ рост микробов с равномерным помутнением среды; 2/ придонный рост; 3/ пристеночный рост; 4/ поверхностный рост.

Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают: степень помутнения - сла-

бая, умеренная, сильная; особенности пленки при поверхностном росте- тон-

кая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая(морщинистая), бесцветная или окрашенная (указывают цвет), сухая или влажная; при образовании осадка указывают - скудный он или обильный, плотный или рыхлый, слизистый или хлопьевидный. Нередко рост микроорганизмов сопровождается пигментацией среды, выделением газа, появлением специфического запаха, что отмечается отдельно при характеристике роста.

110

Лабораторная работа № 2.5.

Рост микроорганизмов в периодической (статической) культуре. Влияние условий культивирования на показатели роста микроорганизмов

К настоящему времени разработано несколько способов культивирования микроорганизмов: периодическое, непрерывное культивирование и культивирование иммобилизованных клеток.

Наиболее распространен способ периодического культивирования. При данном способе инокулят вносится в питательную среду, которая содержит заданное количество всех необходимых питательных веществ. При этом ни один из существенных компонентов питательной среды не поступает в сие тему в процессе культивирования, т.е. это закрытая система. Периодическое культивирование возможно как поверхностных культур(на поверхности твердой питательной среды), так и глубинных культур(в жидкой питательной среде). При внесении микроорганизмов в питательную среду их рост прекращается тогда, когда содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды достигает минимума или в среде накапливаются продукты метаболизма, ингибирующие рост микроорганизмов.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис.1) имеет S-образную форму и характеризуется различными фазами, связанными с изменением состава питательной среды, составом биомассы и физиолого-биохимическими свойствами микроорганизмов.

Рис.1 - Кривая роста периодической культуры микроорганизмов:

I - лаг фаза; II - фаза ускоренного роста; III - фаза логарифмического роста; IV - фаза замедленного роста из-за недостатка источников питания или из-за на-

копления ингибирующих продуктов; V - стационарная фаза;

VI - фаза отмирания клеток

Второй способ культивирования микроорганизмов- рост в непрерывной культуре. Все компоненты питательной среды постоянно поступают в систему и выводятся из нее. Это открытая система осуществляется только в глубинной культуре, чаще всего аэрируемой.

Третий - культивирование иммобилизованных клеток. Клетки микроор-

ганизмов прикрепляются (иммобилизуются) на каких-либо инертных носителях.