Лекция Совершенствование биообъектов

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, конструирование специальными методами клеток нового типа. Клеточная инженерия включает реконструкцию жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, объединение целых клеток, принадлежавших различным видам (и даже относящихся к разным царствам — растениям и животным), с образованием клетки, несущей генетический материал обеих клеток, и другие операции. Клеточная инженерия используется для решения теоретических проблем в биотехнологии, для создания новых форм растений, обладающих полезными признаками и одновременно устойчивых к болезням и т. п.

Новый этап биотехнологии, интенсивно развивающийся в настоящее время, обусловил появление совершенно новых нетрадиционных объектов - культивируемых тканей и клеток высших многоклеточных организмов, животных и растений, а также микроорганизмов, создаваемых методами генетической инженерии. В отличие от микроорганизмов культуры клеток высших организмов являются сравнительно новыми объектами, использование которых позволяет наладить производство ценных биологически активных веществ, вакцин и моноклональных антител.

Идея о возможности культивирования клеток вне организма впервые была высказана в конце прошлого столетия, но первые культуры клеток были получены в начале нашего века, и ими явились, как ни странно, клетки животных, а не растений. А культивирование растительных клеток на искусственных питательных средах долгое время не удавалось. И лишь в 30-е годы были достигнуты первые успехи в этой области, которые и обеспечили бурный расцвет данного направления.

Развитие метода культуры клеток растений приходится на 70-е годы, когда были разработаны методические приемы получения изолированных протопластов растительных клеток, а также метода гибридизации соматических клеток растений.

Клональное микроразмножение. Клональное микроразмножение – это неполовое размножение растений с помощью метода культуры ткани, позволяющая получать растения идентичные исходному.

В основе получения таких растений является способность соматических клеток полностью реализовать свой потенциал развития, то есть свойство тотипотентности.

Преимущества клонального микроразмножения:

1. высокий коэффициент размножения. Одно растение герберы за год – 1 млн. ростков, при обычном способе размножения – 50-100 ростков.

2. получение генетически однородной посадочной культуры.

3. возможность размножения растений плохо репродуцирующих в естественных условиях.

4. круглогодичное получение, не занимая больших площадей.

небольшое время селекционного периода

Клеточная инженерия – широко используется в селекции растений. Выведены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие полезными свойствами и устойчивые к неблагоприятным условиям и болезням. Этот метод и широко используется для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями. Из их ростков в культуре выделяют несколько верхушечных клеток, еще не пораженных вирусом, и добиваются регенерации из них здоровых растений, сначала в пробирке, а затем пересаживают в почву и размножают

Культуры каллусных клеток

Основным типом культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений. Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза. Каллусные клетки в культуре могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов.

Каллусная клетка, при делении которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференциации, свойственной высшему растению. В исключительных ситуациях у нормального растения может возникать каллусная ткань (обычно это случается при травмах), которая функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.

Для получения культивируемых каллусных клеток кусочки (фрагменты) тканей различных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирках, колбах или чашках Петри, строго соблюдая правила стерильности.

Особенности дедифференцирования (т. е. раздифференцировки) клеток экспланта и процесса каллусогенеза (т. е. образования каллуса) зависят от особенностей взятых для этого тканей. Клетки специализированных тканей растения (запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофила листа и т. п.) на питательной среде, содержащей источники углерода, минеральные соли, витамины и вещества гормонального типа, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций, которые они выполняют в растении, и вернуться к состоянию активно делящихся клеток.

Во всех случаях образование каллуса связано с травматическим воздействием, хотя каллусовые клетки могут возникать и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. В настоящее время техника культивирования растительных тканей настолько совершенна, что позволяет получить длительно перевиваемую каллусную культуру из любых живых тканей интактного растения.

Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углерода (обычно сахароза или глюкоза), витамины и регуляторы роста. Иногда возникает необходимость добавления в среду различных комплексных соединений (таких, как гидролизат казеина, смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, различного рода растительные экстракты и т. п.). Как правило, при работе с новым объектом приходится эмпирическим путем подбирать оптимальные составы используемых питательных сред.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. По консистенции каллусные ткани также могут существенно различаться.

Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из которого она получена, как правило, различается. Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяются для поддержания в растущем состоянии коллекций различных штаммов, линий, мутантов; из них получают суспензии клеток для культивирования в жидкой питательной среде, а также для регенерации растений.

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами, хотя этот термин, строго научно говоря, не отражает поведение клеток при таком способе культивирования.

Отдельные клетки, а также небольшие их группы или достаточно крупные агрегаты (несколько десятков клеток) выращиваются во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании различных аппаратов и методов поддержания их в таком состоянии. Начальный момент при получении суспензионных культур клеток в известной степени является событием случайным, поскольку только те клетки, которые в силу каких-то причин оказались способными к перестройке метаболизма и эффективному размножению в данных конкретных условиях, дают начало "хорошим" линиям. Важной особенностью клеток таких линий является их высокая степень дезагрегации (не более 5-10 клеток в скоплении агрегате), морфологическая однородность (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма), а также отсутствие трахеиподобных элементов.

Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных культур. В условиях жидкого культивирования значительно легче влиять на метаболизм и рост клеточных популяций различного рода экзогенными факторами. Суспензионные культуры намного удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов - изучения индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и характеристик получаемых мутантов и т. п.

Клетки для суспензионных культур получают из каллусных тканей, помещая последние в жидкие питательные среды и подвергая их перемешиванию с помощью разнообразных качалок или встряхивателей. Суспензионную культуру можно получить и из растительных тканей, однако это более трудоемкий путь, требующий большего времени. Клетки экспланта при этом способе должны сначала образовать первичный каллус, и лишь после попадания возникших на поверхности каллусных клеток в жидкую среду и их размножения там они дадут начало линии клеток, способных расти в виде суспензии.

Для глубинного культивирования (суспензионные культуры) растительных клеток применяют приемы, используемые в микробиологии. Это и выращивание в замкнутых или открытых системах, при периодическом или непрерывном режимах, однако наиболее изученным и наиболее распространенным способом глубинного культивирования суспензии растительных клеток пока еще остается закрытая периодическая система с использованием ферменторов с механическими мешалками или с аэрацией восходящими воздушными потоками. При указанном способе выращивания рост клеточной популяции характеризуется показателями, довольно близко напоминающими таковые при аналогичном культивировании микробных клеток, т. е. выделяют фазу задержанного роста (лаг-фазу), экспоненциальную фазу, фазу замедленного роста, стационарную и фазу отмирания или деградации клеток. Продолжительность фаз зависит от ряда факторов, связанных как с особенностями выращиваемых объектов, так и составом среды и некоторыми внешними воздействиями.

Генетические изменения (мутации), возникающие в культивируемых клетках, процессы адаптивной селекции, идущие в популяции, приводят к появлению из первичной каллусной ткани линий клеток, различающихся генетически и фенотипически. Это позволяет создавать линии клеток, сохраняющих биосинтетические процессы, присущие исходному растению, а также линии клеток, синтезирующих принципиально новые вещества.

В культурах клеток обнаруживаются традиционные для растений вещества, а также необычные соединения: алкалоиды, гликозиды, полисахариды, эфирные масла, пигменты и пр. Использование растительных клеток для производства ферментных препаратов позволяет получать разнообразные ценные продукты из натуральных или синтетических предшественников. Однако медленный рост, длительное поддержание стерильных условий, чувствительность к механическим повреждениям и ряд других менее существенных недостатков ограничивают применение суспензионных культур растительных клеток в промышленных масштабах. Кроме того, во многих случаях содержание требуемого продукта в суспензионных культурах клеток растений довольно низкое, что также предстоит преодолеть биотехнологам, занимающимся культивированием данных объектов.

Для клональной селекции мутантных, гибридных или трансформированных клеток используются методы выращивания изолированных (отдельных) клеток, которые получаются путем выделения их из суспензий с помощью микроманипуляторов либо посредством разведении, а также из регенерированных протопластов.