№2 Объекты БИОТЕХНОЛОГИЙ

9

Биологические объекты. Предферментационная стадия.

Активным началом в биотехнологических процессах является биологический агент. Ежегодно увеличивается номенклатура биологических агентов. Первое место занимает микробная клетка.

Микробные клетки с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших методов (клеточная и генетическая инженерия) существенно модифицированы и улучшены. При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов. Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиолого-биохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой (контаминации), характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели.

До получения биологического агента, который соответствует принципу технологичности, ни один целевой продукт не может быть рекомендован для крупномасштабных разработок, требующих затраты значительных средств.

Штамм – культура микроорганизма, наследственная однородность которой поддерживается отбором по специфическим фенотипическим признакам, ему принадлежит ключевая роль в производстве.

Штамм – «продуцент» - штамм микроорганизмов, биологический объект, предназначенный для осуществления биотехнологического производства, его природа и физиолого-биоимические свойства определяют все другие качественные характеристики процесса.

Продуценты могут быть получены различными способами. Если природный микроорганизм обладает каким-либо ферментом для осуществления биотехнологического процесса (например, гидролиза), то отбор ведут по наивысшей активности данного фермента, либо по повышенной его концентрации в клетке. Обычно это достигается отбором мутантных форм. Все культуры, используемые в промышленности, подвергают селекции. Отобранные мутантные штаммы хранятся при соответствующих условиях, стабилизирующих полезные свойства микроорганизмоав

Большое внимание уделяется целенаправленному созданию новых, не существующих в природе биологических агентов. Например, создание новых биологических агентов – клеток микроорганизмов, живых растений методами генетической инженерии и биотехнологии.

Наиболее перспективные биологические агенты - рекомбинанты, то есть организмы, полученные методами генетической инженерии:

• Растительные и животные тканевые клетки.

• Анаэробные организмы.

• Ассоциации для превращения сложных субстратов.

• Термофильные микроорганизмы и ферменты.

• Иммобильные биологические агенты.

Процесс искусственного создания биологических агентов (микроорганизма или тканевой клетки) состоит в его генетической информации с целью исключения нежелательных и усиления нужных свойств или придание ему совершенно новых качеств. Наиболее целенаправленное изменение можно получить путем рекомбинации – перераспределяя гены или части генов и объединяя в одном организме генетическую информацию от двух и более организмов. Получение рекомбинантных организмов можно осуществить методом слияния протопластов, путем переноса природных плазмид и методами генной инженерии.

Плазмиды – внехромосомные факторы наследственности, генетические элементы способны существовать в клетке в автономном, не связанным с хромосомным состоянием.

Многие плазмиды представляют кольцевые 2-цепочные молекулы ДНК с молекулярной массой 10⁶ – 10⁸. Они широко распространены в живых клетках.

К нетрадиционным биологическим агентам относятся растительные и животные клетки (например - гибридомы, трансплантаты).

Гибридома – клеточный гибрид, получаемый путем слияния лимфоцита и опухолевой клетки. Она обладает способностью к синтезу моноклональных (однородных) антител желаемой специфичности и неограниченному росту в искусственной среде (свойство опухолевой клетки), что обеспечивает гибридной клетке своеобразное «бессмертие».

Антитела – глобулярные клетки, обладающие способностью специфически связываться с антигенами.

Антигены - вещества, которые воспринимаются организмом как чужеродные и вызывают специфический иммунный ответ.

Идентификация, выделение и синтез защитных антигенов – главная задача при разработке вакцин и сывороток. Культуры клеток млекопитающих являются продуктами интерферона, вирусных вакцин.

Культура клеток растений используется в качестве продуцента лекарственных, ароматных соединений, ферментов, эмульгаторов и других.

В суспензии клеток растений возможно индуцировать эмбриогенез, что используется при микроклональном размножении растений с целью получения высокопродуктивных болезнеустойчивых сортов.

В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы – организмы, развивающиеся в экстремальных условиях среды (термофильные, алкало- и ацидофильные).

Преимуществами использования термофильных микроорганизмов является то, что они менее подвержены вытеснению и обладают стойкой ферментивной системой; не требуют жесткой стерильности процесса ферментации; уменьшают затраты на охлаждение среды.

Биотехнологический процесс при увеличении температуры с использованием термофильных микроорганизмов обладает рядом преимуществ: увеличивается скорость, увеличивается продуктивность, уменьшается возможность микробного заражения реагирующей среды.

Применение экстремально термофильных культур открывает новые перспективы в получении биогаза. Экстремально термофильные микроорганизмы с высокой скоростью метаболизируют S, Fe, Mn и поэтому пригодны для микробного вышелачивания метаболитов и удаления S из угля. Негативные их стороны: ингибируются при низких концентрациях субстратов и продуктов, подвержены перерождению.

Привлекают внимание в связи с недостатком энергии анаэробные микроорганизмы. Анаэробное сбраживание отходов имеет ряд достоинств перед аэробным, достигается значительная минерализация органических веществ, меньше осаждающегося ила.

В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами, микробные ассоциации способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур – охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов.

Особая группа биологических агентов в биотехнологии – ферменты, так называемые катализаторы биологического происхождения. Ферменты находят все большее применение в различных биотехнологических процессах и отраслях хозяйствования, но до 60-х годов это направление сдерживалось трудностями их получения, неустойчивостью, высокой стоимостью. Как отдельную отрасль в создании и использовании новых биологических агентов следует выделить иммобилизованные ферменты, представляющие собой гармонично функционирующую систему, действие которой определяется правильным выбором фермента, носителя и способа иммобилизации.

Хранение музейной культуры. Производственные культуры ( продуценты) хранятся в специальных лабораторных коллекциях и носят название музей микроорганизмов.

Для проведения качественного биотехнологического процесса необходимо поддерживать чистую культуру продуцента. В зависимости от его физиологических свойств и способности сохранять полезные производственные свойства в музейных коллекциях используют:

- периодические пересевы (от 1 раза в две недели, до 1 раза в полгода) на твердых или полутвердых ( полужидких) средах;

- хранение в полужидком агаре под маслом (например, вазелиновым), которое позволяет делать пересевы в 2-3 года;

-спорообразующие объекты (дрожжи, бациллы) можно хранить в запаянных ампулах;

- лиофильно высушенные культуры неспорообразующих клеток;

- культуры, замороженные в жидком азоте.

При любом способе хранение необходимо проводить периодическую проверку музейных культур на сохранение ими продуцирующей активности.

Существуют специфичные методы проверки сохранения свойств биообъекта в зависимости от задач биотехнологического производства.

Перед запуском биотехнологического процесса необходимо получить иннокулят (засевную культуру), что обычно достигается масштабированием.

Культура микроорганизмов – микроорганизмы, выращенные в искусственных условиях в жидкой или плотной питательной среде.

Для роста биообъекта, выбранного в качестве продуцента для синтеза определенных целевых продуктов нужны: исходный жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие факторов, ингибирующих его рост; соответствующие физико-химические условия (рН, температура, аэрация и другие)

Посевной материал готовится в лаборатории в несколько стадий. Сначала выделяется чистая культура – это культура микроорганизмов, полученная из одной клетки. Затем проводятся исследования этой культуры на чистоту, на антибиотическую активность. Далее приступают к наработке засевной партии. Выращивают культуру, выделяют моноизоляты, масштабируют до необходимого объема.

Засевная культура хранится в холодильнике при температуре +4 ⁰С на скошенном МПА в лаборатории приготовления посевного материала, где поддерживается в активном состоянии.

Из пробирки музейного материала получают омоложенную культуру, затем отсевают на чашку Петри с последующим рассевом на 5 – 10 чашек. При выращивании посевных доз инокулята применяют принцип масштабирования, то есть проводят последовательное наращивание биомассы продуцента в колбах, бутылях, далее в серии ферментеров. Каждый последующий этап данного процесса отличается по объему от предыдущего обычно на порядок. Каждый моноизолят рассевают на два скошенных МПА. Затем культуру из пробирки переносят в колбы с ферментационной средой. для выращивания посевного инокулята.

После проверки активности и контроля на чистоту культуры засевают в количестве 5 % от объема питательной среды не менее двух посевных колб объемом 700 мл. Каждой посевной колбой засевают три ферментационные колбы объемом 2 л. Ферментационные колбы проходят проверку на активность, если она удовлетворительна, то колбы снабжаются этикеткой с паспортом культуры и отправляются в цех на засев инокулятора.

После стерилизации в чистый инокулятор загружают среду (коэффициент загрузки 0,5,) и стерилизуют ее сначала глухим паром в рубашку до 70 ⁰С, а затем острым паром до 135 ⁰С и выдерживают 20 мин. При понижении температуры до 37 1 ⁰С аппарат готов к посеву. Выключают вентиляцию, поверхность аппарата моют 3 %-м раствором хлорамина, увлажняют пол. Посев производят ферментационной колбой через спиртовой факел в количестве 0,002 % к объему засеваемой среды.

Инокулят – раствор чистой культуры штамма-продуцента на питательной среде, полученный масштабированием инокулят по стерильной посевной линии направляется далее в аппарат, в котором реализуется ферментационная стадия.

Субстрат – питательная среда, сырье, предназначенное для осуществления ферментации, которое может отличаться в зависимости от поставленных задач биотехнологического процесса. Для проведения биотехнологических процессов культура биообъекта всегда должна быть предварительно выращена, то есть, накоплена биомасса.

Типичный элементарный состав микроорганизма ( в % к весу сухой биомассы): С-50, N-7-12, P-1-3, S-0.5-1, Mg-0.5, микроэлементы. Все клетки содержат также О₂, Н₂. Поэтому среда для выращивания должна включать все эти элементы в нужных соотношениях. Источник углерода в среде часто служит и источником энергии для микроорганизмов. Характерным углеродсодержащим сырьем являются углеводы. Они используются для синтеза клеточных структур и одновременно служат источником энергии. Для промышленного биосинтеза наиболее часто применяют глюкозу или крахмал.

Для успешного культивирования микроорганизмов необходимы:

- источник энергии и углерода (чаще углеводы);

- макроэлементы (в основном – азот, фосфор);

- микроэлементы (широкий набор: медь, кальций, магний и др.);

-факторы роста (ими могут быть витамины, некоторые аминокислоты, гормоны роста и пр.).

Все известные среды для культивирования микроорганизмов, используемые в микробиологической практике, по составу разделяют на две основные группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические. Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с Технологическим регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью вакуумных насосов. Часто применяют принцип предварительных смесей, то есть соли предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам, дозируя их подачу по объему.

По физическому состоянию выделяют на три группы: твердые (приготовленные с агаром, желатиной или на кремневых пластинках); жидкие и сыпучие (увлажненные отруби, зерно).

В промышленных условиях обычно используют натуральные среды неопределенного состава. Натуральными называют среды, которые состоят из природных соединений, продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав.

Большинство из них используется в виде экстрактов или настоек. Преимуществом натуральных сред является то, что на них хорошо развиваются микроорганизмы большинства видов, т.к. в составе таких сред имеются, как правило, все компоненты, необходимые для роста и развития. Кроме того, эти среды легко приготовлять; материал для них дешев и доступен. Натуральные среды используются для поддержания организмов, для накопления биомассы или для диагностических целей.

Различают природные (полные) и синтетические (минимальные) среды.

Комплексные среды содержат кроме известных соединений, включают добавку органических соединений неизвестного состава (например, пептон – продукт переработки мясоперерабатывающей промышленности; экстракт из дрожжевых клеток и т.д.)

Синтетические среды имеют известный состав: соли, углеводы, аминокислоты и др. Составом таких сред легко варьировать, что позволяет оптимизировать процесс накопления биомассы биообъектом.

Однако по стоимости, как правило, такие среды намного дороже комплексных, так как для получения чистых препаратов требуется работа не одного завода. В то время как для получения органических добавок сложного (неизвестного) состава можно использовать существующие производства пищевой промышленности.

При использовании этих продуктов остаются жидкие стоки, имеющие сложный органический состав и требующие длительной очистки, и избытка кислорода. Поэтому перспективным считается непищевое, легко возобновляемое сырье соевая мука. В питательных средах различные источники азота могут быть представлены белками, пептидами или свободными аминокислотами. При промышленной ферментации используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидролизаты дрожжей, а также аммоний, его соли или мочевина. Фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы также в виде солей. Источники витаминов – автолизаты дрожжей, кукурузный экстракт.

Существенное значение имеет соотношение количества присутствующих в среде азота и углерода. Их дозировку необходимо регулировать в соответствии с оптимальными границами концентрации наиболее важных веществ для данной культуры. Для каждого штамма-продуцента эта величина будет различной, изменение соотношения C:N, воздействуя на скорость роста продуцента, метаболизм, вызывает сверхсинтез ряда целевых продуктов (аминокислот, полисахаридов и др.).

При приготовлении среды сырье нужным образом перерабатывают по консистенции, подгоняют рН, удаляют лишние микроэлементы, если штамм не может использовать сахарозу или крахмал, проводят инверсию или ферментативный гидролиз до глюкозы. Целлюлозу подвергают кислотному гидролизу. Нефть очищают отгонкой.

Питательные среды готовят в специальных реакторах с мешалкой поточным методом, или прямо в ферментере. Из питательных веществ часто проблема в кислороде, т.к. он плохо растворим в воде.

Кислород в нормальных условиях может окислить только 8,3 мг глюкозы (в 1 л воды -6,2 мл кислорода, поэтому всегда нужна аэрация т.е. подача стерильного воздуха через специальные фильтры. Ферментер заполняется примерно на 70% объема, т.к. при работе образуется пена. В качестве пеногасителя используются растительные и животные масла, силиконы, механические средства.

При составлении сред для микроорганизмов необходимо учитывать объем выращиваемой культуры, так как часть субстрата просто может быть не использована ввиду ограничений по массообмену (так называемая остаточная концентрация субстрата). Чем меньше остаточная концентрация субстрата после достижения максимальной биомассы, тем экономичнее будет технологический процесс производства конечного продукта

На предферментационной стадии осуществляют хранение и подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологической и рециркулируемой воды и воздуха. Основным на этом этапе является стерилизация всего используемого материала, так как от этого зависит чистота биотехнологического процесса и качество конечного продукта.

Существует несколько методов стерилизации:

- пастеризация – кратковременное прогревание до 70-80°С

-обработка острым, глухим или текучим паром;

- обжиг пламенем (обычно для металлических деталей);

- прогревание сухим жаром при высоких температурах (стекло)

- обработка антисептиком рабочих помещений;

- автоклавирование ( для сред и большинства инструментария);

-стерилизация озоном, радиацией, ультразвуком, ультрофиолетом .

Для стерилизации питательных сред используют непрерывной или периодической методы.

Периодический метод применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до 120-130 ⁰С непосредственно в ферментаторах или котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 мин, после чего охлаждается до температуры культивирования. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно.

Непрерывный метод стерилизации применяют при использовании больших объемов среды. Питательные среды для ферментации приготовляют путем предварительного растворения сахаров и солей и тщательного суспендирования таких нерастворимых компонентов как соевая мука и мел. Тщательная гомогенизация твердых компонентов – необходимое условие стерилизации. В твердых комках, медленно нагревающихся при стерилизации, длительность выдерживания бывает меньше расчетной, и в них сохраняется посторонняя микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость.

Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем применения более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения.

Методы очистки и стерилизации воздуха. Освобождение воздуха от живых микробов может быть достигнуто убивкой их высокой температурой, ионизирующей радиацией или УФ-облучением; применением асептиков (фенола и ртуть содержащих соединений) и т.п. Эти сложные приемы мало экономичны из-за высокой устойчивости спор и конидий к высоким температурам и ионизирующему излучению. В процессах микробиологического синтеза воздух, подаваемый на аэрацию, должен быть практически полностью очищен от примесей и микроорганизмов размером до 1 мкм. Это требование заставляет отказаться от многих приемов газовой очистки (седиментация, механическая фильтрация, методы мокрой очистки – применяются в производстве белка) как неэффективных, обеспечивающих удаление только грубых частиц.

По экономической причине на действующих предприятиях предпочитают удалять микробы путем пропускания воздуха через слой волокнистого (маты, бумага, картон) или насыпного (полимерметаллокерамикс) материала. Другие методы очистки газов, разработанные в химической технологии, малоэффективны и дороги. Несмотря на то, что волокнистые фильтры имеют диаметр не менее 5 мкм и слабое уплотнение, они легко задерживают большинство микроорганизмов со средним размером около 1 мкм.