Ход исследования

Реагенты	Опытная проба	Контрольная проба
Исследуемая плазма	0,1 мл	-
стандартная нормальная плазма	-	0,1 мл
Прогреть пробирку 1 – 2 мин при температуре 37° С
ТКС (или тех-пластин)	0,2 мл	0,2 мл
Одновременно с внесением ТКС (или тех-пластина) включить секундомер и отметить время от момента добавления реагента до образования сгустка фибрина* *

Результаты выражают по одному из следующих вариантов:

1. Отмечают протромбиновое время (ПВ) в секундах больного с указанием значений, полученных при исследовании стандартной нормальной плазмы.

В норме ПВ составляет 12 – 16 секунд.

2. Рассчитывают протромбиновое отношение (ПО) по формуле:

ПО = ПВ больного : ПВ стандартной нормальной плазмы

В норме ПО составляет 0,7 – 1,1 (0,85 – 1, 15)

Построение калибровочного графика для определения концентрации общего белка в пробе.

Для построения калибровочного графика из основного стандартного раствора белка готовят 3 серии рабочих стандартных растворов (т.е. для каждой концентрации делают не менее 2 – 3 определений), как указано в табл. 1 (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30-60 мин замеряют оптическую плотность стандартных и опытных проб против биуретового реактива.

Измерения абсорбции начинают производить с раствора меньшей концентрации.

Таблица 1

Построение калибровочного графика для определения общего белка сыворотки крови

№/№ пробирок	Стандартный раствор белка, мл	Физиологический раствор NaCl, мл	Концентрация белка, г/л
1 2 3 4 5 6 7	0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0	0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 -	40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0

По полученным данным строят калибровочный график на миллиметровой бумаге. На оси абсцисс (горизонтальной) обозначают значения концентраций, на оси ординат (вертикальной) – средние значения экстинкций, соответствующие взятым концентрациям белка. Через полученные точки (а при необходимости – между ними) проводят прямую линию. Масштаб выбирают так, чтобы линия располагалась под углом, близким к 45⁰ (рис. 1).

Рис.1.Калибровочный график для определения общего белка сыворотки крови.

Е – экстинкция

С – концентрация белка

Иногда характер графика для большинства концентраций белка несколько отклоняется от прямой линии, однако если результаты стабильно повторяются, такой график вполне пригоден для работы.

Калибровочную кривую нужно время от времени проверять. При этом достаточно проверить 2 – 3 точки. Если они укладываются на прежнем графике, то он не переделывается. Для облегчения подсчетов составляют таблицу или вычисляют фактор пересчета F делением концентрации белка на абсорбцию F = С_cm/E_cm.

Фактор пересчета F используют для расчета концентрации белка в исследуемой пробе. Для этого экстинкцию (абсорбцию) пробы Е_оп умножают на фактор пересчета F: концентрация белка (г/л) = E_оп●F.

Порядок построения контрольной карты.

1. Подготовьте контрольную сыворотку для исследований (по инструкции).

2. Измерьте концентрацию общего белка в используемом контрольном материале 20 раз (В лаборатории проводят 20-30 измерений, причём каждый день делают по 1-му, 2-м измерениям. Для этого требуется 10-15 дней. Так как вы моделируете проведение контроля качества, то проводите в один день 20 измерений. Занесите результаты в таблицу.

№ опр.	Хi	Хср-Хi	(Хср-Хi)²
1
2
3
Хср.			∑=

3.По полученным результатам вычислите Хср., S и CV%.

4.Сильно отклоняющиеся от среднего значения результаты («выбросы») могут сдвинуть среднее значение и увеличить S. Поэтому, если после проведения расчётов выяснится, что какой-либо результат отклоняется от Хср. больше чем на 3S, то исключите его из расчёта. После этого заново рассчитайте Хср., S и CV%. Однако таких «выбросов» недолжно быть более одного, если же их больше, то надо выяснить причину, по которой это могло произойти и устранить её.

5.Рассчитанный CV% сравните с допустимым для данного показателя по таблице №1, если он больше, то надо выяснить причину плохой воспроизводимости и устранить её.

6.Рассчитайте смещение В% от аттестованного значения и сравните с допустимым для данного показателя отклонения. Если полученное значение В% превышает допустимое, необходимо выявить и устранить причины систематической ошибки.

7.Рассчитайте предупредительные и контрольные границы карты: Хср-1S, Хср.+1S, Хср.-2S, Хср.+2S, Хср.-3S, Хср.+3S.

8.На миллиметровой бумаге начертите ось ординат. На оси абсцисс (Х) отложите номер аналитической серии или дату её выполнения (так как вы моделируете, то отложите номера измерений:1,2,3,4, и т.д.), соблюдая масштаб. На оси ординат (Y) – значения общего белка (в масштабе). Через середину оси ординат проведите линию, соответствующую Хср. и параллельно оси абсцисс. Параллельно линии Хср. нанесите предупредительные и контрольные границы: Хср-1S, Хср.+1S, Хср.-2S, Хср.+2S, Хср.-3S, Хср.+3S. Таким образом, вы начертили карту Шухарта. Для каждого определяемого вещества ( аналита) строится своя карта.

9.Подклейте миллимитровку с картой в свою тетрадь.

10. Ведение карты заключается в регулярном (ежедневном) нанесении на неё результатов измерения определяемого вещества в контрольном материале.

ОБЩАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ – качество измерений, отражающее близость друг к другу результатов всех измерений (определяется внутрисерийной и межсерийной воспроизводимостью). Воспроизводимость отражает разброс результатов повторных измерений одной и той же пробы, вызванный случайными ошибками. Различают воспроизводимость в серии, во времени и межлабораторную. Численной мерой воспроизводимости является среднеквадратическое отклонение (S) и коэффициент вариации (CV%)

Чем больше среднеквадратическое отклонение, тем больше случайная ошибка, т.е. хуже воспроизводимость измерений, и тем больший разброс может получаться между результатами повторных измерений одной и той же пробы.

Расчет коэффициента вариации (СV% или V%)

Коэффициента вариации – характеристика воспроизводимости измерений, определяемое как стандартное отклонение, выраженное в процентах от среднего значения.

Где: CV% - коэффициент вариации в %

S - среднеквадратичная ошибка

Хср - среднее значение

1. Коэффициент вариации показывает воспроизводимость метода в процентах, он рассчитывается по формуле СV% = S : X • 100%, СV% = 2 : 70 • 100% = 2,86%

2. Воспроизводимость удовлетворительная, так как в таблице допустимых значений указано, что коэффициент вариации не должен превышать 5%, а по расчётам коэффициент вариации – 2,86%.