- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
Изображенная на рис. 1.3.1. схема описывает стадии сворачивания полипептидной цепи, кодируемой одним геном. Многие белки, однако, возникли в процессе эволюции в результате слияния разных генов; участки полипептидных цепей таких белков, кодируемые разными генами, сворачиваются независимо друг от друга, по разным путям и с разными скоростями, образуя после сворачивания глобулярные структуры, называемые доменами. Рисунок 1.3.1. показывает схему сворачивания белка, состоящего из одного домена. Формирование нативной структуры белков, состоящих из двух или более доменов, усложняется за счет дополнительной стадии – установления специфических контактов между доменами. Ситуация еще более усложняется, когда функционально активна олигомерная форма белка (то есть состоящая из нескольких полипептидных цепей, каждая из которых после сворачивания образует так называемую субъединицу). В этих случаях добавляется еще одна стадия – установление контактов между субъединицами.
Нужно отметить, что формирование междоменных и межсубъединичных контактов также может оказать определенное влияние на скорость и эффективность сворачивания полипептидной цепи.
Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
Рассмотрение зависимости между размером полипептидной цепи, формирующей мономерную субъединицу фермента, и степенью сложности выполняемой этим ферментом функции, выявляет прямую корреляцию между данными параметрами.
Поскольку молекулярная масса структурных доменов, выявляемых в белках, как правило, составляет 20-30 кДа, можно полагать, что наиболее просто устроенные ферменты представляют собой однодоменные образования. Усложнение структуры, обычно достигаемое путём увеличения числа доменов (и реализующееся в эволюции благодаря дупликации генов с последующими мутациями либо благодаря слиянию генов), влечет за собой усложнение функции. Анализ накопленной к настоящему времени информации позволяет наметить три основные направления, по которым может осуществляться «усовершенствование» функциональных свойств ферментов. Это, во-первых, усложнение структуры активного центра, отражающееся на специфичности фермента и эффективности катализа. Во-вторых, это возникновение дополнительных структур, обеспечивающих способность молекулы фермента воспринимать сигналы внешней среды, то есть подвергаться аллостерической регуляции. И, наконец, это появление полифункциональных ферментов, структурные особенности которых делают их способными к тонкой регуляции путём специфических белок-белковых взаимодействий.
Роль доменов в формирование активного центра фермента
Сведения о структуре активных центров ферментов, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют, что во всех случаях они формируются в междоменной области. Как правило, мономерный фермент или субъединица олигомерного фермента состоит из двух доменов, связанных «шарнирным» фрагментом и разделённых «щелью», в которой и осуществляется каталитический акт. Именно такое расположение активного центра даёт возможность использовать движение доменов относительно друг друга (а также иные формы движения полипептидных цепей – главным образом различных «петель») для осуществления катализа. Важной особенностью строения ферментов является разъединение участков связывания для нескольких субстратов реакции, поскольку они, как правило, связываются с разными доменами. Обычно два субстрата связываются с двумя доменами, а затем движение доменов приводит к формированию продуктивного комплекса, в составе которого и происходит каталитический акт. Перемещение доменов и иные формы конформационной подвижности, наблюдаемые при связывании участников реакции и в процессе формирования продуктивного комплекса, приводят к сипьному изменению взаимного расположения важных для катализа аминокислотных остатков и, по существу, к формированию активного центра. Эти наблюдения наглядно иллюстрируют предложеную Кошлaндом гипотезу индуцированного соответствия, в которой взаимодействие субстратов и ферментов осуществляется по принципу «рука – перчатка».