- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Роль металлов в функционировании ферментов
Более 25% всех ферментов для проявления полной каталитической активности нуждается в ионах металлов. Роль металлов в ферментативном катализе разнообразна.
Во-первых, металл может способствовать образованию промежуточного соединения между ферментом и субстратом. Именно такой случай наблюдается при действии лейцинаминопептидазы и карбоксипептидазы А – присоединение фермента к субстрату осуществляется, благодаря образованию координационных связей через атом марганца (или магния) и атом цинка (рис. 1.4.24).
Рис. 1.4.24. Роль металла в присоединении субстрата к ферменту
Во-вторых, металл может сам участвовать в реакции, например в переносе электронов, то есть в окислительно-восстановительных реакциях. Это происходит при действии нитратредуктазы. Входящий в состав данного фермента молибден сам взаимодействует с нитратом и затем с флавиновым ферментом, который, в свою очередь, реагирует с содержащей NАD+ или NАDР+ дегидрогеназой. Это ясно из рис. 1.4.25.
Рис. 1.4.25. Участие молибдена в действии нитратредуктазы
В-третьих, металл может обеспечивать сохранение вторичной, третичной и четвертичной структуры ферментного белка. В этом отношении прекрасным примером является α-амилаза. Все виды α-амилазы – панкреатическая, солодовая, плесневая, бактериальная и слюнная – содержат кальций, который необходим именно для поддержания вторичной и третичной структуры фермента.
Лишённая кальция α-амилаза имеет такую же активность, как и нативный, содержащий кальций фермент. Это ясно видно из рис. 1.4.26. Этот же рисунок показывает, что фермент, лишенный кальция, крайне неустойчив, чрезвычайно легко денатурируется и теряет активность в результате двухчасовой инкубации при рН, отклоняющемся от оптимального.
Рис. 1.4.26. Стабильность α-амилазы Bacillиs sиbtilis при инкубации в течение двух часов при 25º и разных рН (по Э. Фишеру и сотр.). 1 – без Cа2+; 2 – с Са2+
Рис. 1.4.27. Влияние ЭДТА и трипсина на α-амилазу Bacillиs sиbtilis (по Э. Фишеру). 1 – инкубация с трипсином; 2 – инкубация с ЭДТА; 3 – инкубация с ЭДТА и трипсином (рН 7,5; 25º)
Таким образом, при оптимальном рН вторичная и третичная структура фермента поддерживается благодаря водородным и другим дополнительным связям; при более кислой и более щелочной реакции среды на первый план в качестве фактора, стабилизирующего структуру фермента, выступает кальций.
Стабилизация структуры фермента под влиянием кальция проявляется также в том, что фермент, лишенный кальция, очень легко расщепляется протеолитическими ферментами. Это видно на рис. 1.4.27, показывающем активность α-амилазы, обработанной трипсином и ЭДТА, который связывает кальций, образуя е ним прочнoe внутрикомплексное соединение (хелат). Из рисунка также видно, что трипсин практически не расщепляет α-амилазу; однако если α-амилаза предварительно обработана ЭДТА, то она быстро расщепляется трипсином. Таким образом, кальций в данном случае играет роль фактора, предохраняющего α-амилазу от расщепления протеолитическими ферментами.
Что касается роли металла в поддержании четвертичной структуры ферментного белка, то в этом отношении хорошим примером является дрожжевая алкоголь дегидрогеназа. Этот фермент имеет молекулярную массу 151 кДа, содержит четыре атома цинка в молекуле и четыре молекулы NАD+. Удаление цинка из молекулы алкогольдегидрогеназы вызывает не только её инактивацию, но и диссоциацию ферментного белка на четыре неактивные субъединицы с молекулярной массой 36 кДа каждая.
Наконец, четвертый возможный способ действия металла – когда металл способствует соединению апофермента с коферментом. Подобное действие металла наблюдается в случае алкогольдегидрогеназы и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.
Заканчивая раздел, посвященный роли металлов в ферментативном катализе, нужно подчеркнуть, что за последние годы все чаще выявляется, что тот или иной металл в незначительных количествах играет важную роль в ферментативных реакциях. Роль так называемых микроэлементов в обмене веществ растений и животных как раз и заключается в том, что они необходимы для построения и нормального функционирования целого ряда ферментов.
Все это еще раз свидетельствует о том, что различные стороны обмена веществ неразрывно связаны между собой – недостаток или нарушение обмена какого-либо металла в растительном или животном организме сразу же сказывается на действии того или иного фермента, вызывая соответствующее заболевание