Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB
.pdfли ни одно из животных второй группы не погибает и не обнаруживает признаков
недомогания в течение указанного промежутка времени.
ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
Если не предписано иное, каждой из пяти здоровых мышей массой от 17 до
22 г подкожно вводят 0,5 мл препарата. Животных наблюдают в течение 7 дней. Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных не показывает зна- чительной локальной или системной реакции. Если погибает более одного живот- ного, препарат не выдерживает испытание. Если одно из животных погибает или
показывает значительную локальную или системную реакцию, испытание повто- ряют. Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных второй группы
не погибает и не показывает значительной локальной или системной реакции в течение указанного промежутка времени.
Испытание также должно быть проведено на двух здоровых морских свин- ках массой от 250 до 300 г. Внутрибрюшинно вводят каждому животному не менее
2 мл препарата. Препараты, содержащие вспомогательные вещества, вводят под- кожно. Животных наблюдают в течение 7 дней. Препарат выдерживает испыта- ние, если ни одно из животных не показывает значительной локальной или сис-
темной реакции. Если погибает более одного животного, препарат не выдержива-
ет испытание. Если одно из животных погибает или показывает значительную ло-
кальную или системную реакцию, испытание повторяют. Препарат выдерживает испытание, если ни одно из животных второй группы не погибает и не показывает
значительной локальной или системной реакции в течение указанного промежутка
времени.
2.6.10. ГИСТАМИН
Убивают морскую свинку массой от 250 до 350 г, которая была лишена пи- щи в течение предшествовавших 24 часов. Извлекают участок периферийной тон- кой кишки длиной 2 см и опорожняют отделенную часть путем тщательной про- мывки раствором В, описанным ниже, с помощью шприца. К каждому из концов
присоединяют тонкую нить и делают маленький поперечный разрез в центре
фрагмента кишки. Помещают её в ванночку для органов, вместимостью от 10 до
20 мл, содержащую раствор B, поддерживаемый при постоянной температуре (от 340С до 360С), и пропускают через раствор смесь 95 частей кислорода и 5 частей
диоксида углерода. Укрепляют одну из нитей рядом с дном ванночки для органов.
Другую нить присоединяют к изотоническому миографу и регистрируют сокраще-
ния органа с помощью кимографа и другим подходящим способом непрерывной регистрации. Если используется рычаг, его длина должна быть такой, чтобы дви-
жение органа усиливались приблизительно в 20 раз. Натяжение кишки должно со- ставлять около 9,8 мН (1 г) и быть отрегулировано в соответствии с чувствитель- ностью органа. Промывают ванночку для органов раствором В. Выдерживают в течение 10 минут. Промывку раствором В повторяют еще 2 или 3 раза. Стимули-
руют серию сокращений путем добавления измеренных объемов от 0,2 до 0,5 мл раствора гистамина дигидрохлорида R, имеющего концентрцию, которая вызы- вает воспроизводимые субмаксимальные реакции. Эту дозу обозначают как «вы-
сокую дозу». Перед каждым добавлением гистамина ванночку для органов триж- ды промывают (предпочтительно, путем переполнения без опорожнения ванноч-
ки) раствором В. Последовательные добавления следует выполнять, соблюдая
равные интервалы времени, достаточные для полной релаксации между добав-
лениями (около 2 минут). Добавляют равные объемы более разбавленного рас-
твора гистамина дигидрохлорида R, приводящего к воспроизводимым реакциям, составляющим примерно половину от реакций, вызываемых «высокой дозой». Эту
дозу обозначают как «малую дозу». Продолжают периодическое добавление «вы- соких» и «низких» доз раствора гистамина, следуя вышеуказанному, и чередуют
каждое добавление с равным объемом разведения испытуемого раствора, регу- лируя степень разбавления таким образом, чтобы сокращение кишки, в случае его наличия, было меньшим, чем сокращение, вызываемое «высокой дозой» гистами- на. Определяют, является ли сокращение, в случае его наличия, воспроизводи-
мым и остаются ли реакции на «высокую» и «низкую» дозы гистамина неизмен- ными. Вычисляют активность испытуемой субстанции, выраженную в ее эквива-
ленте на микрограмм основания гистамина, основываясь на определенном выше разведении.
Определенное таким образом количество не должно превышать количест- во, указанное в частной статье.
Если испытуемый раствор не вызывает сокращений, готовят свежий рас- твор, добавляя количество гистамина, соответствующее максимально допустимо- му в соответствии с требованиями частной статьи, и отмечают, соответствуют ли сокращения, вызываемые препаратом с добавкой гистамина, количеству добав- ленного гистамина. Если такого соответствия не наблюдается, или сокращение,
вызываемое испытуемой субстанцией, не воспроизводимо, или последующие ре- акции на «высокие» и «низкие» дозы гистамина уменьшаются, то результаты ис-
пытания считают недостоверными и выполняют испытание на депрессорные ве-
щества (2.6.11).
Раствор А |
|
Натрия хлорид |
160,0 г |
Калия хлорид |
4,0 г |
Кальция хлорид, безводный |
2,0 г |
Магния хлорид, безводный |
1,0 г |
Натрия гидрофосфат додекагидрат |
0,10 г |
Вода для инъекций R |
До 1000 мл |
Раствор В |
|
|
Раствор А |
50,0 мл |
|
Атропина сульфат |
0,5 |
мг |
Натрия гидрокарбонат |
1,0 |
г |
Глюкозы моногидрат |
0,5 |
г |
Вода для инъекций R |
До 1000 мл |
|
Раствор В должен быть свежеприготовленным, и его используют в течение 24 ча- сов.
2.6.11. ДЕПРЕССОРНЫЕ ВЕЩЕСТВА
Испытание проводят на кошке массой не менее 2 кг, анестезированной с использованием хлоралозы или барбитурата, что позволяет поддерживать посто-
янное кровяное давление. Животное защищают от потери температуры тела и поддерживают ее таким образом, чтобы ректальная температура оставалась в
физиологических пределах. В трахею вводят дыхательную трубку. В общую сон- ную артерию вводят канюлю, наполненную гепаринизированным раствором хло- рида натрия концентрацией 9 г/л, и присоединяют ее к устройству, обеспечиваю- щему постоянную регистрацию кровяного давления. В бедренную вену вводят
другую канюлю, наполненную гепаринизированным раствором хлорида натрия концентрацией 9 г/л, через которую может быть введен раствор гистамина и испы-
туемого образца. Определяют чувствительность животного к гистамину путем
внутривенного введения через равные промежутки времени раствора гистамина
R в дозах, соответствующих 0,1 мкг и 0,15 мкг основания гистамина на килограмм массы тела. Введение меньшей дозы повторяют не менее трех раз. Вторую и по-
следующие инъекции вводят не ранее, чем через одну минуту после того, как кро- вяное давление возвращается к уровню, наблюдавшемуся непосредственно пе- ред предыдущей инъекцией. Животное используют в испытании только в случае, если получено четко регистрируемое снижение кровяного давления, являющееся
постоянным для меньшей дозы, а большая доза вызывает более высокую реак- цию. Испытуемое вещество растворяют в растворе хлорида натрия концентраци-
ей 9 г/л или в другом растворителе, указанном в частной статье и взятом в коли-
честве, достаточном для получения предписанной концентрации. Вводят внутри- венно на килограмм массы тела 1,0 мл раствора гистамина R, затем две после-
довательные инъекции предписанного в частной статье количества испытуемого
раствора и, наконец, 1,0 мл раствора гистамина R. Вторую, третью и четвертую инъекции вводят не ранее, чем через одну минуту после того, как кровяное дав- ление возвращается к уровню, наблюдавшемуся непосредственно перед преды- дущей инъекцией. Эти серии инъекций повторяют дважды и завершают испыта- ние введением 1,5 мл раствора гистамина R на килограмм массы тела.
Если реакция на 1,5 мл раствора гистамина R на килограмм массы тела не
превышает реакцию на 1,0 мл того же раствора, результаты испытания признают
недостоверными. Испытуемый образец не выдерживает испытание, если среднее значение реакции на его введение превышает среднее значение реакции на 1,0
мл раствора гистамина R на килограмм массы тела, или если любая из доз об-
разца вызвала более высокую депрессорную реакцию, чем завершающая доза раствора гистамина. Лабораторное животное не следует использовать в другом
испытании на депрессорные вещества, если любая из испытанных доз вызывает
более выраженную депрессорную реакцию, чем завершающая доза раствора гис- тамина, или если реакция на высокую дозу гистамина, введенную после испытуе- мой субстанции, менее среднего значения реакции на введенные ранее меньшие дозы гистамина.
# Испытание на содержание веществ гистаминоподобного действия может быть проведено также в соответствии с нижеизложенным методом.
Испытание проводят на кошках обоего пола массой не менее 2 кг, анесте- зированной с использованием хлоралозы, зооксилазина, рометара или барбиту- рата, что позволяет поддерживать постоянное кровяное давление.
Для регистрации артериального давления в отпрепарированную сонную ар- терию вставляют канюлю, заполненную раствором, предупреждающим свертыва- ние крови (насыщенный раствор натрия гидрокарбоната, 25% раствор магния
сульфата, раствор гепарина, содержащий 50 ЕД в 1 мл и др.) и соединяют ее с
ртутным манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.
Испытуемые растворы вводят внутривенно. Вначале проверяют чувстви-
тельность животного к гистамину. Для приготовления основного раствора гиста- мина, содержащего 1 мг гистамина-основания в 1 мл воды, около 138,1 мг (точная
навеска) гистамина фосфата или около 82,8 мг (точная навеска) гистамина дигид- рохлорида растворяю в 50 мл дистиллированной воды.
Раствор хранят не более 1 месяца в склянке из темного стекла с притертой пробкой в защищенном от света месте при температуре от 4 до 100С.
В качестве основного раствора гистамина можно использовать также 0,1% раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах, в 1 мл которого содержится 0,6038
мг гистамина-основания.
Из основного раствора гистамина непосредственно перед опытом путем по-
следовательных разведений в воде или в растворе натрия хлорида изотоническо- го 0,9% для инъекций, в зависимости от растворителя для испытуемого препара-
та, указанного в соответствующей статье, готовят стандартные растворы, содер- жащие 0,5 и 1 мкг/мл гистамина-основания.
Для проверки реакции животного на гистамин в вену последовательно вво- дят указанные стандартные растворы с промежутками не менее 5 минут в дозах
0,1 и 0,2 мкг гистамина-основания в 0,2 мл на 1 кг массы. Скорость введения рас-
твора 0,1 мл в секунду. Животных, у которых при введении гистамина в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы артериальное давление снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из
опыта исключают.
После проверки чувствительности животного к гистамину уточняют величи- ну гипотензивной реакции посредством повторного введения стандартного рас- твора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2 мл раствора) на 1 кг массы со скоростью 0,1 мл в секунду. Введение гистамина с интервалом 5 минут повторяют несколько раз, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимается за стандартное в дан-
ных условиях опыта.
Затем с интервалом не менее 5 минут животному вводят испытуемый рас- твор лекарственного средства с той же скоростью, с которой вводили раствор гис-
тамина.
Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест-доза) указаны в
соответствующей фармакопейной статье.
Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение артериального
давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг гистамина в стандартном растворе.
При испытании в одном опыте разных лекарственных средств необходимо проводить дополнительное определение реакции животного на введение стан-
дартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг/кг. Отмеченная при этом величина ре- акции принимается за стандартную для последующего испытания препарата.
В случае значительного уменьшения величины реакции по сравнению с на- блюдаемой в начале опыта необходимо вновь проверить чувствительность жи- вотного к действию гистамина в дозе 0,2 мкг/кг. Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм рт. ст., испытание препаратов продол- жают в соответствии с указанными выше требованиями.
2.6.12. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ НЕСТЕРИЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ (СУММАРНОЕ КОЛИЧЕСТВО ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ АЭРОБОВ)
Испытания, описанные ниже, позволяют осуществлять количественное оп-
ределение мезофильных бактерий и грибов, способных расти в аэробных услови- ях.
Испытания предназначены прежде всего для того, чтобы определить, соот- ветствует ли субстанция требованиям микробиологической чистоты, приведенным
в частной статье. Если испытания проводят с этой целью, выполняют требования, изложенные ниже, включая количество образцов, отбираемых для анализа, и ин-
терпретацию полученных результатов. Приведенные ниже методики могут быть
также использованы при испытании эффективности антимикробных консервантов
(5.1.3), в соответствии с Фармакопеей. Кроме того, их можно использовать при оп- ределении качества сырья и готовых лекарственных средств в соответствии с ре-
комендациями, изложенными в статье «Микробиологическая чистота лекарст-
венных средств» (5.1.4). В этом случае, например, при определении производи- телем качества сырья и/или готовых лекарственных средств или при проведении проверки пригодности выбранной методики порядок проведения исследования, в том числе количество образцов, отбираемых для анализа, и интерпретацию полу-
ченных результатов производитель устанавливает при согласовании с компетент- ным уполномоченным органом.
Выполняют испытания в условиях, позволяющих избежать случайной кон-
таминации испытуемого продукта. Меры предосторожности, предпринимаемые для предотвращения контаминации, не должны влиять ни на один из микроорга- низмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, она должна быть подходящим образом нейтрализо- вана. Если для этой цели используют инактиваторы, должна быть продемонстри- рована их эффективность и нетоксичность в отношении микроорганизмов.
# Если всвязи с природой лекарственного средства нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в отношении данного тест-штамма не эффективны,
этот вид испытания не проводят.
Суммарное количество жизнеспособных аэробов определяют методом мембранной фильтрации, чашечным методом подсчета или методом последова- тельных разведений, в соответствии с указаниями в частной статье.
# Допускается использование автоматизированных методов испытаний.
Метод наиболее вероятного числа предназначен для использования в тех
случаях, когда другие методы использовать невозможно. При выборе метода ис-
пытания необходимо учитывать природу испытуемого лекарственного средства и
ожидаемое количество микроорганизмов. Необходимо надлежащим образом про- вести проверку пригодности выбранной методики.
Если испытание проводится в соответствии с разделом 5.1.3 или 5.1.4, сле- дует использовать методы глубинного, поверхностного, двухслойного высева на
чашки Петри или метод мембранной фильтрации.
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА
Порядок отбора проб. Отбор проб лекарственного средства необходимо
проводить в строго определенном порядке. Порядок отбора проб зависит от объ-
ема серии, степени опасности для здоровья, связанной с микробным загрязнени-
ем лекарственного средства выше допустимого уровня, характеристиками лекар- ственного средства и ожидаемым уровнем микробного загрязнения. Если нет дру-
гих указаний в частной статье, для испытания используют образцы по 10 г или 10 мл субстанции или лекарственного средства, отобранные с вышеупомянутыми
мерами предосторожности. Образец (образцы) отбирают случайным образом из массы испытуемого материала или из контейнеров с лекарственным средством. Для отбора средней пробы, при необходимости, смешивают содержимое доста-
точного количества контейнеров для получения образца необходимой массы или
объема, в зависимости от природы испытуемой субстанции или препарата.
Примером плана отбора проб является трехуровневый порядок пробоотбо-
ра, используемый для лекарственных средств с большой вероятностью неравно- мерного распределения микроорганизмов. Этот план предусматривает отбор от
каждой серии пяти образцов, каждый из которых испытывают отдельно. При этом допускают, что в результате исследования могут быть выявлены образцы, харак-
теризующиеся тремя уровнями микробного загрязнения: (i) – соответствующие образцы, содержащие меньше m колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамме или миллилитре, где m – предельно допустимое количество микроорганизмов, уста- новленное соответствующей частной статьей; (ii) – граничные образцы, содержа- щие в грамме или миллилитре больше m, но меньше 10m КОЕ; (iii) – бракованные
образцы, содержащие больше 10m КОЕ в грамме или миллилитре.
Водорастворимые продукты. 10 г или 10 мл испытуемого продукта рас-
творяют в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона рН 7,0 или дру-
гой подходящей жидкости. Обычно готовят разведение в соотношении 1:10. Одна-
ко характеристики некоторых продуктов или требуемая чувствительность могут обусловить необходимость использования других соотношений. Если известно, что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю может быть добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значение рН при- близительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с использовани-
ем того же растворителя.
Нерастворимые в воде продукты, не относящиеся к жирам. 10 г или 10
мл испытуемого продукта суспендируют в буферизированом растворе хлорида
натрия и пептона рН 7,0 или в другой подходящей жидкости. Обычно готовят раз-
ведение в соотношении 1:10, но характеристики некоторых продуктов могут обу- словить необходимость использования больших объемов. Для облегчения сус-
пендирования плохо смачиваемых субстанций может быть добавлен подходящий
поверхностно-активный компонент, например, полисорбат 80 в количестве 1 г/л. Если известно, что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю
может быть добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значе- ние рН приблизительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с ис-
пользованием того же растворителя.
Жиры. 10 г или 10 мл испытуемого продукта гомогенизируют с полисорба- том 80 или с другим подходящим стерильным поверхностно-активным агентом, взятым в количестве, не превышающем половины массы испытуемого образца, и при необходимости нагретым до температуры, не превышающей 400С, в исключи- тельных случаях – 450С. Осторожно перемешивают, при необходимости поддер-
живая температуру с помощью водяной бани или инкубатора. Добавляют предва-
рительно нагретый буферизированный раствор хлорида натрия и пептона рН 7,0 в количестве, достаточном для получения разведения исходного продукта в соот-
ношении 1:10. Осторожно перемешивают, поддерживая температуру в течение минимального промежутка времени, необходимого для образования эмульсии, и в
любом случае не превышающего 30 минут. Дальнейшие серийные десятикратные
разведения могут быть приготовлены с использованием буферизированного рас- твора хлорида натрия и пептона рН 7,0, содержащего стерильный полисорбат 80
или другой стерильный поверхностно-активный агент в подходящей концентра- ции.
Трансдермальные пластыри. Десять пластырей освобождают от защит-
ного покрытия с помощью стерильного пинцета и помещают в стерильные пласт- массовые или стеклянные лотки клейкой поверхностью вверх. При необходимости
клейкую поверхность накрывают стерильной марлей или сеткой из полимерного
моноволокна типа тканого фильтра и переносят 10 пластырей в емкость, вме- щающую не менее 500 мл буферизированного раствора хлорида натрия и пепто-
на рН 7,0, содержащего подходящий инактиватор, например, полисорбат 80 или лецитин. Энергично встряхивают не менее 30 минут (образец А). Другую группу из
10 пластырей готовят аналогичным образом и помещают в емкость, содержащую не менее 500 мл жидкой питательной среды D, и энергично встряхивают не ме-
нее 30 минут (образец B).
ИСПЫТАНИЕ ОБРАЗЦА
Мембранная фильтрация. Используют мембранные фильтры с номиналь-
ным размером пор, не превышающим 0,45 мкм, с установленной способностью к
удерживанию бактерий. Тип фильтрующего материала выбирают таким образом, чтобы компоненты испытуемого образца не влияли на эффективность удержива-
ния бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы используют для
водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры на основе ацетата целлюлозы – в частности, для растворов с высоким содержанием спирта.
Конструкция аппарата для фильтрования должна обеспечивать перенос фильтра на питательную среду.
Подходящее количество образца, приготовленного в соответствии с указа- ниями раздела «Подготовка образца» (предпочтительно, соответствующее 1 г
продукта, или меньшему количеству, если ожидается наличие большого числа ко-
лониеобразующих единиц), наносят на каждый из двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют. Каждый фильтр промывают тремя порциями, приблизи-
тельно по 100 мл каждая, подходящей жидкости, например, буферизированного
раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0. К этому раствору могут быть добавле- ны поверхностно активные агенты, например, полисорбат-80, или инактиваторы антимикробных компонентов. Допускается проведение менее трех промывок, при
условии проведения проверки пригодности такой методики. Один из мембранных фильтров, предназначенный преимущественно для подсчета бактерий, переносят
на поверхность чашки с подходящей агаризованной средой, например, агаризо-
ванной средой В # или средой №1, а другой, предназначенный преимущественно для подсчета грибов, - на поверхность чашки с подходящей агаризованной сре-
дой, например, агаризованной средой С # или средой №2. Чашку с агаризованной
средой В (# средой №1) инкубируют при температуре от 300С до350С, а чашку с агаризованной средой С (# средой №2) – при температуре от 200С до 250С в тече-
ние 5 дней, если за более короткое время не могут быть получены достоверные
результаты. Выбирают чашки с максимальным количеством колоний менее 100 и вычисляют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре ис-
пытуемого продукта.
При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А фильтруют по отдельности через каждый из двух стерильных мембранных фильтров. Одну мем-
брану помещают на агаризованную среду В # или среду №1 для определения об-
щего числа аэробов, а другую мембрану – на агаризованную среду С # или среду №2 для подсчета грибов.
МЕТОДЫ ЧАШЕЧНОГО ПОДСЧЕТА
А. Метод глубинного посева. Используют чашки Петри диаметром 9 см. В
каждую чашку помещают 1 мл образца, подготовленного в соответствии с указа- ниями раздела «Подготовка образца», и 15–20 мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды №1) или 15–20 мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культи-
вирования грибов (например, среды С или среды №2), при температуре, не пре- вышающей 450С. Если используются чашки Петри большего размера, то соответ-
ственно увеличивают количество агара. Готовят для каждой среды не менее двух чашек с каждым из разведений. Чашки инкубируют при температуре от 300С до
350С (от 200С до 250С для грибов) в течение 5 дней, если за более короткое время не могут быть получены достоверные результаты. Выбирают чашки, соответст-
вующие одному разведению, на которых максимальное число колоний менее 300 (100 для грибов). Вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний и определяют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре.
В. Метод поверхностного посева. Используют чашки Петри диаметром 9
см. В каждую чашку помещают 15–20 мл расплавленной агаризованной среды,
подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды №1) или 15–20 мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивиро-
вания грибов (например, среды С или среды №2), при температуре около 450С и
дают среде застыть. Если используются чашки Петри большего размера, то соот- ветственно увеличивают количество агара. Чашки сушат, например, в условиях ламинарного потока воздуха или в инкубаторе. Отмеренный объем образца, под- готовленного в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца», со- ставляющий не менее 0,1 мл, распределяют по поверхности среды. Готовят для каждой среды не менее двух чашек с каждым из разведений. Инкубацию и под-
счет количества колониеобразующих единиц производят в соответствии с выше-
приведенными указаниями для метода глубинного высевания.
# Двухслойный агаровый метод. 1 мл подготовленного продукта вносят в
две пробирки с 4 мл расплавленной и охлажденной до 450С среды №1 (для опре-
деления количества бактерий). Содержимое пробирки быстро перемешивают, пе- реносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды №1, и равномерно распределяют по поверхности. Для количественного определения
грибов поступают аналогичным способом, используя среду №2. Инкубирование посевов, подсчет колоний бактерий и грибов выполняют, как описано выше.
МЕТОД НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА
Метод наиболее вероятного числа (НВЧ) уступает по точности методам мембранной фильтрации и чашечного подсчета. Особенно недостоверными яв-
ляются результаты подсчета плесневых грибов. Поэтому метод НВЧ следует при- менять лишь для подсчета бактерий в тех случаях, когда другие методы недос-
тупны. Если применение данного метода обосновано, определение проводят в соответствии с нижеследующими указаниями.
Готовят ряд не менее, чем из трех последовательных десятикратных раз-
ведений продукта, в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца».
Для каждого уровня разведения используют три аликвоты по 1 г или 1 мл для ино-
куляции трех пробирок, содержащих от 9 до 10 мл подходящей жидкой питатель-
ной среды (например, питательной среды А). При необходимости, к среде могут быть добавлены поверхностно-активные агенты (например, полисорбат 80) или
инактиваторы антимикробных компонентов. Таким образом, для трех уровней разведения готовят для инокуляции девять пробирок. Все пробирки инкубируют
при температуре от 300С до 350С в течение 5 дней. Для каждого уровня разведе- ния записывают количество пробирок, в которых наблюдается микробный рост.
Если природа испытуемого продукта приводит к получению неопределенных или трудно оцениваемых результатов, производят пересев на ту же жидкую среду или
на подходящую агаризованную среду (например, агаризованную среду В), инкуби- руют при той же температуре от 18 до 24 часов и для подсчета используют полу-
ченные результаты. Наиболее вероятное количество микроорганизмов в грамме или миллилитре испытуемого продукта определяют по Таблице 2.6.12.-1.
Таблица 2.6.12.-1
Наиболее вероятное число микроорганизмов
Три пробирки для каждого уровня разведения
Количество пробирок с на- |
НВЧ |
|
Категория* |
Пределы 95% до- |
|||||
блюдаемым ростом микроор- |
в 1 г |
|
|
|
верительного ин- |
||||
|
ганизмов |
|
|
|
|
|
|
тервала |
|
0,1 г |
0,01 г |
0,001 г |
|
|
1 |
2 |
|
|
|
0 |
0 |
0 |
< 3 |
|
|
|
- |
|
- |
0 |
1 |
0 |
3 |
|
|
× |
< 1 |
|
17 |
1 |
0 |
0 |
3 |
× |
|
|
1 |
|
21 |
1 |
0 |
1 |
7 |
|
|
× |
2 |
|
27 |
1 |
1 |
0 |
7 |
× |
|
|
2 |
|
28 |
1 |
2 |
0 |
11 |
|
|
× |
4 |
|
35 |
2 |
0 |
0 |
9 |
× |
|
|
2 |
|
38 |
2 |
0 |
1 |
14 |
|
|
× |
5 |
|
48 |
2 |
1 |
0 |
15 |
× |
|
|
5 |
|
50 |
2 |
1 |
1 |
20 |
|
|
× |
8 |
|
61 |
2 |
2 |
0 |
21 |
× |
|
|
8 |
|
63 |
3 |
0 |
0 |
23 |
× |
|
|
7 |
|
129 |
3 |
0 |
1 |
38 |
× |
|
|
10 |
|
180 |
3 |
1 |
0 |
43 |
× |
|
|
20 |
|
210 |
3 |
1 |
1 |
75 |
× |
|
|
20 |
|
280 |
3 |
2 |
0 |
93 |
× |
|
|
30 |
|
390 |
3 |
2 |
1 |
150 |
× |
|
|
50 |
|
510 |
3 |
2 |
2 |
210 |
|
|
× |
80 |
|
640 |
3 |
3 |
0 |
240 |
× |
|
|
100 |
|
1400 |
3 |
3 |
1 |
460 |
× |
|
|
200 |
|
2400 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
× |
|
|
300 |
|
4800 |
3 |
3 |
3 |
> 1100 |
|
|
|
- |
|
- |
* Категория 1: Нормальные результаты, получаемые в 95% случаев.
Категория 2: Менее вероятные результаты, получаемые только в 4% случаев.
Их не следует использовать при принятии важных решений. Результаты, еще ме-
нее вероятные, чем относящиеся к категории 2, не приводятся и всегда являются
