Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB
.pdfобнаруженных на агаризованной среде С # или среде №2. Суммарное количество
жизнеспособных аэробов представляет собой сумму числа бактерий и числа гри- бов, определенных выше. Если имеются доказательства роста на обеих средах
микроорганизмов одинаковых типов, могут быть внесены соответствующие по- правки. Если подсчет выполнен методом наиболее вероятного числа, то вычис-
ленное значение представляет собой количество бактерий.
При использовании трехуровневого плана отбора проб поступают следую- щим образом.
Определяют общее число микроорганизмов отдельно для каждого из пяти
образцов. Считают, что субстанция или готовое лекарственное средство удовле- творяет требованиям по микробиологической чистоте, если выполняются сле-
дующие условия:
(i)– общее число микроорганизмов, определенное для каждого испытуемо-
го образца, не превышает допустимый уровень больше чем в 10 раз (отсутствуют бракованные образцы),
(ii)– не более чем для двух испытуемых образцов общее число микроорга- низмов, определенное в результате испытания, находится в интервале между до- пустимым уровнем и десятикратным значением (то есть не более двух предель-
ных образцов).
Использование трехуровневого плана отбора проб должно быть предусмот-
рено в частной статье.
Если в частной статье предписано максимальное значение, оно должно ин-
терпретироваться следующим образом:
102 микроорганизмов – максимально допустимое значение: 5х102; 103 микроорганизмов – максимально допустимое значение: 5х103; и т.д.
#Если при испытании образца методом мембранной фильтрации при раз- ведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на мем- бранных фильтрах, результаты выражают следующим образом: «В 1 г (мл) лекар-
ственного средства (сырья) бактерии (грибы) не выявлены».
#В том случае, если при испытании образца методом высева на чашки при
разведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на
чашках, результаты отмечают следующим образом: «В 1 г (мл) лекарственного
средства (сырья) менее 10 бактерий».
#Если в частной статье приведены допустимые пределы содержания мик- роорганизмов, результаты интерпретируют следующим образом:
102 микроорганизмов – максимально допустимое значение: 1х102; 103 микроорганизмов – максимально допустимое значение: 1х103; и т.д.
Рекомендуемые растворы и питательные среды описаны в общем разделе 2.6.13.
2.6.13. МИКРОБИЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ НЕСТЕРИЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ (ИСПЫТАНИЯ НА НАЛИЧИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ)
Методики, изложенные в данной статье, допускают использование селек-
тивных питательных сред, которые не позволяют выделять микроорганизмы с сублетальными повреждениями. Так как для обеспечения качества лекарственно-
го средства необходимо выявлять микроорганизмы с сублетальными поврежде- ниями, следует предусмотреть проведение процедуры восстановления их жизне-
способности перед использованием селективных питательных сред.
Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, она должна быть соответствующим способом нейтрализована.
# Допускается использование автоматизированных методов испытаний, ес-
ли в результате проверки пригодности было доказано, что они имеют результаты, идентичные описанным ниже методам. Для биохимической идентификации мик-
роорганизмов могут быть использованы готовые тест-системы.
Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии
Испытание предназначено для определения бактерий семейства Enterobacteriaceae, но также позволяет определять и другие типы микроорганизмов (напри-
мер, Aeromonas, Pseudomonas).
Определение наличия бактерий. Готовят испытуемый продукт в соответст- вии с указаниями, приведенными в разделе 2.6.12, но с использованием пита-
тельного бульона D вместо буферизированного раствора хлорида натрия и пеп-
тона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-370С в течение промежутка времени, достаточного для оживления бактерий и недостаточного для иницииро-
вания их размножения (обычно 2 часа, но не более 5 часов). Контейнер встряхи-
вают, переносят количество содержимого [гомогенат (а)], соответствующее одно- му грамму или одному миллилитру продукта, в 100 мл обогащенного питательного бульона Е и инкубируют при 35-370С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой F. Инкубируют при 35-370С в течение 18-24 часов. Про- дукт выдерживает испытание, если ни на одной из чашек не наблюдается рост грамотрицательных бактерий.
# 10 мл испытуемого образца, подготовленного, как описано в разделе 2.6.12, но с использованием среды №11 вместо буферного раствора с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0, вносят в 100 мл питательной среды № 3, перемеши-
вают и инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 24 - 48 ч. При нали-
чии роста делают пересев на среду № 4 в чашке Петри. Посевы инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 ч. Наличие роста малиновых с металли- ческим блеском или без него; розовых, бесцветных, блестящих, выпуклых колоний
грамотрицательных палочек указывает на возможное загрязнение лекарственного средства бактериями сем. Enterobacteriaceae и некоторыми другими грамотрица-
тельными бактериями. Выросшие колонии пересевают, каждую отдельно, со сре- ды № 4 на скошенную в пробирках среду № 1 и выращивают при температуре 30 -
35°С течение 18 - 20 ч. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пересевы на среды № 6 и № 7.
После посева в половину пробирок со средой № 6 вносят по 0,5 мл сте- рильного вазелинового масла. Все посевы инкубируют при температуре 30 - 35°С
в течение 18 – 20 ч. Ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды № 6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него. О наличии нит- ритов в среде № 7 судят по появлению красного окрашивания при внесении в
среду реактива Грисса. Параллельно исследуют чистые культуры на наличие
фермента цитохромоксидазы. Если в образце обнаружены грамотрицательные
неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию,
ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и восста- навливают нитраты в нитриты, лекарственное средство контаминировано бакте-
риями семейства Enterobacteriaceae.
# Тест на цитохромоксидазу. Полоску фильтровальной бумаги смачивают
реактивом и наносят стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий со среды №1. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свиде- тельствует о положительной оксидазной реакции.
Количественная оценка. Инокулируют подходящие количества питательно-
го бульона Е гомогенатом (а) и/или его разбавлениями, содержащими, соответст- венно, 0,1г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта.
Инкубируют при температуре 35-370С в течение 24-48 часов. Каждую из культур пересевают на чашку с агаризованной средой F для достижения селективного
разделения. Инкубируют при температуре 35-370С в течение 18-24 часов. Рост хорошо развитых колоний грамотрицательных бактерий, обычно красной или
красноватой окраски, представляет собой положительный результат. Отмечают наименьшее количество продукта, дающее положительный результат, и наи- большее количество, дающее отрицательный результат. Вероятное количество бактерий определяют по таблице 2.6.13.-1.
# Инокулируют подходящие количества среды №3 гомогенатом и /или его разбавлениями, содержащими, соответственно, 0,1 г, 0,01 г и 0,001 г (или 0,1 мл, 0,01 мл и 0,001 мл) испытуемого продукта. Инкубируют при температуре 30 - 350С
в течение 24 – 48 ч. При наличии роста делают пересев на плотную среду №4
(агар Эндо) и инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч. В случае по- явления характерных для Enterobacteriaceae колоний грамотрицательных палочек определяют количество энтеробактерий в 1 г или в 1 мл образца по Таблице
2.6.13.-1.
|
|
|
Таблица 2.6.13.-1. |
|
|
|
|
Результаты для каждого количества продукта |
Вероятное количество |
||
0,1 г или 0,1 мл |
0,01 г или 0,01 мл |
0,001 г или 0,001 |
бактерий в грамме |
|
|
мл |
продукта |
+ |
+ |
+ |
Более 103 |
+ |
+ |
- |
Менее 103, но более |
|
|
|
102 |
+ |
- |
- |
Менее 102, но более |
|
|
|
10 |
- |
- |
- |
Менее 10 |
|
|
|
|
При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца В пропускают через стерильный мембранный фильтр, как описано в разделе 2.6.12., помещают
мембрану в 100 мл обогащенной питательной среды Е и инкубируют при темпера- туре 35–37 0С 18–24 часа. После окончания инкубации делают пересев на по-
верхность агаризованной среды F для выявления энтеробактерий и других гра-
мотрицательных микроорганизмов.
Escherichia coli
Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела
2.6.12. 10 мл образца или количество, представляющее 1 г или 1 мл продукта, по- мещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при 35370С в течение 18-48 часов. Контейнер встряхивают, переносят 1 мл содержимого в 100 мл питательной среды G и инкубируют при 43-450С в течение 18-24 часов.
Пересевают на чашки с агаризованной средой H и инкубируют при 35-370С в те- чение 18-72 часов. Рост красных, немукоидных колоний грамотрицательных пало-
чек указывает на возможное присутствие E.coli. Для подтверждения проводят со- ответствующие биохимические тесты, например, по образованию индола. Продукт
выдерживает испытание, если подобные колонии не обнаруживаются или под- тверждающие биохимические реакции дают отрицательный результат.
# 10 мл образца в питательной среде №11 или количество, представляю-
щее 1 г или 1 мл продукта, подготовленное и инкубированное как описано в раз- деле «Энтеробактерии и некоторые другие грамотрицательные бактерии. Количе-
ственная оценка», помещают в 100 мл питательной среды №3 и инкубируют при
температуре 30-350С в течение 18-24 часов Пересевают на среду № 4 и инкуби-
руют при температуре 30 - 35°С в течение 18-24 часов. На среде № 4 E.coli обра- зуют, как правило, характерные малиновые колонии с металлическим блеском
или без него, диаметром 2-4 мм. Подозрительные на принадлежность к E.coli ко-
лонии микроскопируют. При обнаружении грамотрицательных палочек отсевают на скошенную в пробирках плотную среду №1 и инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 18-24 часов. Из каждой пробирки с чистой культурой делают пере- севы на среды №14 (агар Симмонса) и №15 (бульон Хоттингера), а также исполь- зуют для теста на цитохромоксидазу. Через 18-24 часа инкубации при 30 - 35°С отмечают бактериальный рост или его отсутствие на средах № 14 и № 15. Утили-
зацию цитрата устанавливают по изменению цвета среды №14 из зеленого в си-
ний. Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности среды № 15 при добавлении реактива Ковача или Эрлиха.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па-
лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминиро-
вано E. coli.
Salmonella
Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела
2.6.12, но с использованием питательного бульона А вместо буферизированного раствора хлорида натрия и пептона рН 7,0, гомогенизируют и инкубируют при 35-
370С в течение 18-24 часов. 1 мл обогащенной культуры переносят в 10 мл пита- тельного бульона I и инкубируют при 41-430С в течение 18-24 часов. Пересевают
не менее чем на две различные агаризованные среды, выбранные из агаризован-
ных сред J, К и L. Инкубируют при 35-370С в течение 18-72 часов. На возможное присутствие сальмонелл указывает рост культур, имеющих следующие характер- ные признаки:
Агаризованная среда J: хорошо развитые бесцветные колонии.
Агаризованная среда К: хорошо развитые красные или красные с черным цен-
тром колонии.
Агаризованная среда L: маленькие прозрачные бесцветные или обладающие окраской от розовой до белой колонии, часто окружен-
ные зоной розового или красного цвета.
Несколько подозрительных колоний переносят по отдельности на агаризо-
ванную среду М в пробирках с использованием поверхностной и глубинной иноку- ляции. Присутствие сальмонелл предварительно подтверждается, если имеется изменение окраски из красной в желтую и, как правило, газообразование в случае глубинной, но не поверхностной инокуляции. При этом в агаре может образовы-
ваться сероводород. Окончательный вывод делают на основе соответствующих биохимических и серологических испытаний. Продукт выдерживает испытание,
если культура описанного типа не обнаруживается или подтверждающие биохи- мические и серологические испытания дают отрицательный результат.
# 1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл сре-
ды № 12 (селенитовая среда) и инкубируют при 30 - 35°С в течение 16-18 часов.
Делают пересев петлей на среду № 5 (висмут-сульфит агар) и инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 часов. На среде № 5 Salmonella образует, как правило, типичные черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Подозри- тельные на принадлежность к Salmonella колонии микроскопируют и, при обнару-
жении в мазках грамотрицательных палочек, отсевают на среду №13 (трехсахар- ный агар с солями железа), нанося небольшое количество культуры петлей сна-
чала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик. Параллельно ставят
тест на цитохромоксидазу, используя чистую культуру с плотной среды № 1. Че- рез 18-24 часа инкубации при 30 – 350С отмечают изменение цвета среды из красного в желтый только в столбике питательной среды. Почернение среды сви- детельствует об образовании сероводорода.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие па- лочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не ферментирующие саха-
розу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство
контаминировано Salmonella.
Pseudomonas aeruginosa
Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12. 10 мл образца или количество, соответствующее 1 г или 1 мл продукта, помещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при
35-370С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашки с агаризованной средой N и инкубируют при 35-370С в течение 18-72 часов. Если рост микроорганизмов не на-
блюдается, то продукт выдерживает испытание. Если имеется рост колоний гра- мотрицательных палочек, выполняют пересев некоторого количества различаю-
щихся по морфологическим признакам изолированных колоний на питательный бульон А и инкубируют при 41-430С в течение 18-24 часов. Продукт выдерживает
испытание, если при 41-430С роста не происходит.
При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А пропускают
через стерильный мембранный фильтр в соответствии с указаниями общего раз- дела 2.6.12, помещают мембранный фильтр в 100 мл жидкой среды А и инкуби- руют при температуре 35-370С в течение 18-48 часов. После окончания периода
инкубации пересевают на поверхность агаризованной среды N.
# Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды № 8,
перемешивают и инкубируют при температуре 30 - 35°С в течение 24 - 48 часов. Делают пересев на чашку с плотной питательной средой №9 и инкубируют при
температуре 30-350С от 18 до 48 часов. Рост зеленоватых, как правило, флюо- ресцирующих колоний, голубых в ультрафиолетовом свете (что свидетельствует
о наличии пигмента пиоцианина) указывает на возможность загрязнения лекарст- венного средства Pseudomonas aeruginosa. В этом случае подозрительные коло- нии пересевают на скошенную плотную среду №1, инкубируют при температуре 30-350С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии микроскопируют и, при выяв-
лении грамотрицательных палочек, проводят тест на наличие фермента цитохро- моксидаза. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие
палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию и образуют сине- зеленый пигмент, лекарственное средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa.
Staphylococcus aureus
Испытуемый продукт готовят в соответствии с указаниями общего раздела 2.6.12. 10 мл образца или количество, соответствующее 1 г или 1 мл продукта,
помещают в 100 мл питательного бульона А, гомогенизируют и инкубируют при
35-370С в течение 18-48 часов. Пересевают на чашку с агаризованной средой О и
инкубируют при 35-370С в течение 18-72 часов. Наличие черных колоний грампо- ложительных кокков, окруженных прозрачными зонами, свидетельствует о присут-
ствии S. aureus. Подтверждение может быть получено путем проведения соответ-
ствующих биохимических тестов, например, на коагулазу и дезоксирибонуклеазу. Продукт выдерживает испытание, если культура описанного типа на агаризован-
ной среде О не обнаруживается или подтверждающие биохимические испытания дают отрицательный результат.
При испытании трансдермальных пластырей 50 мл образца А пропускают через стерильный мембранный фильтр в соответствии с указаниями общего раз-
дела 2.6.12, помещают мембранный фильтр в 100 мл жидкой среды А и инкуби-
руют при температуре 35-370С в течение 18-48 часов. После окончании периода инкубации пересевают на поверхность агаризованной среды О.
#Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной среды № 8, перемешивают и инкубируют при температуре 30-35°С в течение 24 - 48 часов.
Делают пересев на чашку с плотной питательной средой №10 и инкубируют при температуре 30-350С от 18 до 48 часов. Рост золотисто-желтых колоний, окружен-
ных желтыми зонами (что свидетельствует о ферментации маннита), указывает на возможность загрязнения лекарственного средства S. aureus. В этом случае
подозрительные колонии пересевают на скошенную плотную среду №1, инкуби- руют при температуре 30-350С в течение 18-24 часов. Выросшие колонии микро-
скопируют и, при выявлении грамотрицательных кокков, расположенных гроздья- ми, проводят тест на наличие фермента плазмокоагулаза.
#Тест на наличие плазмокоагулазы (реакция плазмокоагуляции) Кровь,
взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в 5 % стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1:5 0,9% стерильным рас-
твором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные про- бирки. В каждую пробирку помещают 1 петлю суточной культуры стафилококка и
инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 4 - 6 часов. Если в течение этого времени не наблюдают свертывание плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной. Обязательно наличие двух контролей: 1) контроль рас-
твора плазмы, 2) контроль культуры стафилококка, обладающего ферментом коа-
гулазой.
#Допускается использовать сухую кроличью цитратную плазму промыш-
ленного производства, которую разводят согласно наставлению по применению.
#Если в образце обнаружены грамположительные кокки, которые фермен-
тируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции, лекарственное средство контаминировано Staphylococcus aureus
Клостридии
Нижеописанные испытания проводят в различных целях. Первый метод предназначен для тех случаев, когда важным является исключение патогенных
клостридий, и необходимо провести испытание на их отсутствие. Эти продукты обычно содержат небольшое общее количество микроорганизмов. Второй метод
представляет собой полуколичественное определение Clostridium perfringens, и предназначен для продуктов, в которых количество этих микроорганизмов являет-
ся критерием качества.
1. Испытание на клостридии. Готовят испытуемый продукт, как описано в
разделе 2.6.12. Отбирают две равные порции, соответствующие 1 г или 1 мл про- дукта. Одну из порций нагревают при 800С в течение 10 минут и быстро охлажда-
ют. Другую порцию не нагревают. По 10 мл каждой из гомогенизированных порций
переносят в две пробирки (38х200 мм) или в другие подходящие контейнеры, со- держащие 100 мл среды Р. Инкубируют в анаэробных условиях при 35-370С в те-
чение 48 часов. После инкубации делают пересев из каждой пробирки на среду Q
с добавлением гентамицина и инкубируют в анаэробных условиях при 35-370С в течение 48 часов. Если роста микроорганизмов не наблюдается, продукт выдер- живает испытание.
При наличии роста делают пересев каждой отдельной колонии на пита- тельную среду Q без гентамицина и инкубируют как в аэробных, так и в анаэроб- ных условиях. Наличие только анаэробного роста грамположительных палочек (с
эндоспорами или без них), дающих отрицательную реакцию на каталазу, указыва-
ет на присутствие Clostridium spp. При необходимости сравнивают морфологию
колоний на двух чашках и проводят испытания на каталазу для исключения
аэробных и факультативно анаэробных Bacillus spp, дающих положительную ре-
акцию на каталазу. Это испытание может применяться к изолированным колониям на агаре или после их переноса на предметное стекло, путем добавления капли разбавленного раствора пероксида водорода R. Образование пузырьков газа яв-
ляется признаком положительной реакции на каталазу.
2. Количество Clostridium perfringens. Используя продукт, подготовленный в
соответствии с указаниями раздела 2.6.12, готовят разведения в соотношениях 1:100 и 1:1000 в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона рН 7,0.
Определяют наиболее вероятное число бактерий, как описано в разделе 2.6.12, используя питательную среду R в пробирках или других подходящих контейнерах
с помещенной внутрь маленькой трубкой Дюрама. Перемешивают при минималь- ном встряхивании и инкубируют при 45,5-46,50С в течение 24-48 часов. Наличие в
пробирках черного окрашивания, вызванного образованием сульфида железа, и сильного газообразования в трубках Дюрама (не менее 1/10 объема) указывает на присутствие Cl. perfringens. Наиболее вероятное количество C. рerfringens оцени-
вают с использованием Таблицы 2.6.13.-2.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблица 2.6.13.-2 |
||
|
|
Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий |
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
Три пробирки для каждого уровня разведения |
|
|
|||||||
Количество пробирок с на- |
НВЧ |
|
Категория* |
|
Пределы 95% до- |
||||||
блюдаемым ростом микроор- |
в 1 г |
|
|
|
|
верительного ин- |
|||||
|
ганизмов |
|
|
|
|
|
|
тервала |
|||
0,1 г |
0,01 г |
|
0,001 г |
|
|
1 |
2 |
|
|
|
|
0 |
0 |
|
0 |
< 3 |
|
|
|
|
- |
|
- |
0 |
1 |
|
0 |
3 |
|
|
× |
|
< 1 |
|
17 |
1 |
0 |
|
0 |
3 |
× |
|
|
|
1 |
|
21 |
1 |
0 |
|
1 |
7 |
|
|
× |
|
2 |
|
27 |
1 |
1 |
|
0 |
7 |
× |
|
|
|
2 |
|
28 |
1 |
2 |
|
0 |
11 |
|
|
× |
|
4 |
|
35 |
2 |
0 |
|
0 |
9 |
× |
|
|
|
2 |
|
38 |
2 |
0 |
|
1 |
14 |
|
|
× |
|
5 |
|
48 |
2 |
1 |
|
0 |
15 |
× |
|
|
|
5 |
|
50 |
2 |
1 |
|
1 |
20 |
|
|
× |
|
8 |
|
61 |
2 |
2 |
|
0 |
21 |
× |
|
|
|
8 |
|
63 |
3 |
0 |
|
0 |
23 |
× |
|
|
|
7 |
|
129 |
3 |
0 |
|
1 |
38 |
× |
|
|
|
10 |
|
180 |
3 |
1 |
|
0 |
43 |
× |
|
|
|
20 |
|
210 |
3 |
1 |
|
1 |
75 |
× |
|
|
|
20 |
|
280 |
3 |
2 |
|
0 |
93 |
× |
|
|
|
30 |
|
390 |
3 |
2 |
|
1 |
150 |
× |
|
|
|
50 |
|
510 |
3 |
2 |
|
2 |
210 |
|
|
× |
|
80 |
|
640 |
3 |
3 |
|
0 |
240 |
× |
|
|
|
100 |
|
1400 |
3 |
3 |
|
1 |
460 |
× |
|
|
|
200 |
|
2400 |
3 |
3 |
|
2 |
1100 |
× |
|
|
|
300 |
|
4800 |
3 |
3 |
|
3 |
> 1100 |
|
|
|
|
- |
|
- |
* Категория 1: Нормальные результаты, получаемые в 95% случаев.
Категория 2: Менее вероятные результаты, получаемые только в 4% случаев.
Их не следует использовать при принятии важных решений. Результаты, еще ме- нее вероятные, чем относящиеся к категории 2, не приводятся и всегда являются неприемлемыми.
Контроль. Используют следующие тест-штаммы:
Для метода 1: Clostridium sporogenes, например, АТСС 19404 (NCTC 532)
или CIP 79.3; # ГИСК 272
Для метода 2: Clostridium perfringens, например, АТСС 13124 (NCIMB 6125 и
NCTC 8237, CIP 103 409).
При необходимости, комбинируют с Сl. sporogenes для проверки селектив-
ности и анаэробных условий.
Ростовые свойства питательных сред и проверка пригодности методики испытания
Описанные ниже испытания следует проводить, как минимум, для каждой
партии сухой питательной среды.
В пробирках с подходящими средами (например, указанными ниже) выра-
щивают по отдельности нижеприведенные тест-культуры при температуре 30-
350С в течение 18–24 часов. |
|
|
Staphylococcus aureus |
например, |
АТСС 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83) |
|
# или |
ATCC 6538 P |
|
|
питательный бульон А, # жидкая среда |
|
|
№1 |
Pseudomonas aeruginosa |
например, |
ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118) |
|
|
питательный бульон А, # жидкая среда |
|
|
№1 |
Escherichia coli |
например, |
ATCC 8739 (NCIB 8545, CIP 53.126), |
|
# или |
АТСС 25922 |
|
|
питательный бульон А, # жидкая среда |
|
|
№1 |
Salmonella typhimurium |
|
Рекомендации по конкретным штам- |
|
|
мам отсутствуют. Может быть также |
использован штамм не патогенный для
человека, например, Salmonella abony
(NCTC 6017, CIP 80.39);
питательный бульон А, # жидкая среда №1
Порции каждой из культур разбавляют буферизированным раствором хло- рида натрия и пептона рН 7,0, получая тест-суспензии, содержащие около 1000 жизнеспособных микроорганизмов в миллилитре. Смешивают равные объемы ка-
ждой суспензии и используют 0,4 мл полученной смеси (приблизительно 100 мик-
роорганизмов каждого штамма) в качестве инокулята для проведения испытаний на E.coli, Salmonella, Ps. аeruginosa и S. aureus, при необходимости, в присутствии
и в отсутствии испытуемого продукта. Для соответствующих микроорганизмов
должен быть получен положительный результат.
#Тест-культуры можно выращивать на скошенной в пробирках плотной пи- тательной среде подходящего состава, например, среде №1. Для получения тест-
суспензий выращенные в пробирках культуры смывают раствором натрия хлори- да 0,9% и разводят этим же раствором до нужного содержания клеток в милли-
литре, используя стандарт мутности.
#Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных средств
Определение антимикробного действия нестерильных лекарственных
средств можно проводить с использованием следующих тест-микроорганизмов:
Bacillus cereus |
ATCC 10702 (NCTC 8035) |
Escherichia coli |
ATCC 25922 |
Pseudomonas aerugiosa |
ГИСК 453, АТСС 9027 |
Staphylococcus aureus |
АТСС 6538-Р (FDA 209-Р) |
Сandida albicans |
АТСС 885-653 |
Aspergillus niger |
BKM F-1119 |
Проведение испытания
Перед определением антимикробного действия культуры бактерий отсева- ют на скошенную в пробирках плотную питательную среду №1 и инкубируют при
температуре от 300С до 350С в течение 18-24 часов.
Культуры грибов выращивают на скошенной плотной питательной среде №2 при температуре от 200С до 25 0С, С. аlbicans – 48 часов, А. niger – 7 суток.
Со скошенного агара культуры бактерий и С. аlbicans смывают раствором
натрия хлорида 0,9%, культуру А. niger – этим же раствором с 0,05% полисорбата 80. Полученные суспензии разводят до концентрации 103 КОЕ/мл для культур бак-
терий и 103 – 104 КОЕ/мл для культур грибов.
Определение антимикробного действия для водорастворимых лекар-
стенных средств
Готовят разведения лекарственного средства 1:10; 1:20; 1:50 (при необхо-
димости ряд разведений может быть продолжен), используя фосфатный буфер- ный раствор (для приготовления эмульсий в раствор добавляют не более 5 % по- лисорбата 80).
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в чашки Петри
диаметром 90 мм, в одни из которых добавляют по 0,2 мл взвеси культуры В. сereus, а в другие – по 0,2 мл культуры С. albicans и А. niger. В чашки с В. сereus
вносят по 15-20 мл расплавленной среды № 1 при температуре (45 - 50) 0С, в
чашки с культурами С. albicans и А. niger – то же количество среды № 2.
Каждое разведение лекарственного средства вносят по 1 мл в пробирки с 10 мл жидкой среды - № 3 и № 8. В пробирки со средой № 3 добавляют по 1 мл взвеси культуры Е.coli, в пробирки со средой № 8 – по 1 мл взвеси культур Р.aeruginosa и S.aureus, каждую отдельно. В контрольные чашки и пробирки вме-
сто разведения лекарственного средства вносят такое же количество буферного
раствора.
Посевы на средах № 1, 3, 8, инкубируют при температуре от 300С до 35 0С в течение 2 суток (среды № 3, № 8) и 5 суток (среда № 1). Посевы на среде № 2 ин-
кубируют при температуре от 200С до 250С в течение 5 суток. В случае, если при
внесении лекарственного средства в жидкие питательные среды (№ 3, № 8) обра- зуется помутнение, препятствующее учету результатов, делают пересев со среды
№3 на среду № 4 (агар Эндо), а со среды № 8 – на среды № 9 и № 10. При росте
типичных колоний Е.coli (среда № 4), Р.aeruginosa (среда № 9) и S.aureus (среда
№10) отмечают наличие роста тест-микроорганизма.
Определение антимикробного действия для водонерастворимых лекар-
ственных средств (метод репликаций).
В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемо- го лекарственного средства. В контрольные чашки вносят по 1 мл растворителя, который используют для получения разведения. В чашки Петри (как в экспери- менте, так и в контроле) добавляют по 15-20 мл расплавленной и охлажденной до (45 - 50) 0С среды № 1, в другие – такое же количество среды № 2 и быстро пере-