18.Визначте сутність, напрямки та перспективи розвитку генетичної інженерії.

Генна інженерія–сукупність методів отримання in vitro нових комбінацій генетичного матеріалу,який має різне походження та здатного до реплікації та функціонування у клітині.Сутність генної інженерії полягає у виділенні і штучному створенні функціонально активних генетичних структур з наступним введенням їх в організм з метою цілеспрямованої перебудови його генотипу.при цьому введений матеріал повинен стати складовою частиною генетичної системи господаря:реплікуватися разом з його ДНК,виконувати регуляторні команди клітини,включатися в процеси транскрипції і трансляції та забезпечувати синтез відповідних продуктів і прояв нових, не властивих для даного організму ознак і властивостей.1972 р.генна інженерія виникла як самостійний напрям.Пол Берг,Д. Джексон і Р.Симонс(США)опублікували роботу про створення штучним шляхом першої рекомбінантної(«гібридної»)молекули ДНК.До її складу входили фрагменти ДНК вірусу SV40 (онкогенний вірус мавпи),бактеріофагу λ та Escherichia coli. Етапи генної інженерії: 1.Синтез генів.У 1968 р.Х.Корана вперше синтезував ген аланінової тРНК.Виходячи з нуклеотидної послідовності аланінової тРНК,Корана спроектував на папері структуру гена,з якого вона транскрибується,а потім синтезував його.Блоки гена синтезувались методами класичного органічного синтезу.Для їх з'єднання використовувався фермент ДНК–лігаза.Лігаза здійснює репарацію розривів ланцюгів молекули ДНК,каталізуючи зєднання фосфату одного нуклеотиду з цукром іншого.Успішне з'єднання блоків забезпечувалося також і тим,що вони мали «липкі кінці»одноланцюгові комплементарні виступи,які,зєднюючисьь між собою,утримували фрагменти разом для того,щоб лігаза проявила свою дію.Це хімічний синтез.Повна і функціонально активна генна структура(ген + регуляторна ділянка,всього 199 нуклеотидів)була синтезована Кораною в 1976 р.Штучно створений ним ген тирозинової тРНК E.coli. Працював під час введення в геном фага T4 в клітинах кишкової палички.Великі за розмірами гени одержують методом ферментативного синтезу(метод зворотної транскрипції).З клітини виділяють певний тип іРНК,яка є комплементарною копією гена.На цих копіях за допомогою зворотної транскриптази синтезують відповідний ген.Цей фермент здійснює синтез ДНК у напрямі 5'-3',який приєднує по одному нуклеотиду шляхом комплементарного спарювання основ з іРНК-матрицею.Продукт реакції становить собою гібридну молекулу,яка складається з РНК-матриці,що з'єднана з комплементарним ланцюгом ДНК.Одержаний комплекс руйнюють лугом (на ДНК луг не впливає).Внаслідок цього утворюється одноланцюгова комплемен-тарна ДНК(кДНК).За допомогою ДНК-полімерази перетворюють одно ланцюгову кДНК у дволанцюгову шляхом добудови комплементарного ланцюга.Завдяки зворотній транскриптазі був знайдений шлях для синтезу будь-якого з існуючих генів, незалежно від їх складності.За відкриття цього фермента Д.Балтімор і Х.Тьомін були удостоєні в 1975 р.Нобелівської премії.Метод рестрикції.Рестриктази вперше були виділені з E.coli в 1968 р.Виявилося,що вони здатні розрізати молекули ДНК на різних сайтах рестрикції.Ці ферменти отримали назву ендонуклеаз класу I.Потім у бактерій були виявлені ендонуклеази класу II,які розпізнають в чужорідній ДНК сайти рестрикції специфічно і на цих сайтах теж здійснюють рестрикцію.Саме ферменти цього класу стали використовувати в генній інженерії.Дія системи рестрикції-модифікації «раціоналізується»так званими паліндромами(розпізнаючі послідовностя-ми)азотистих основ,які є сайтами рестрикції ДНК.Паліндромні послідовності-це послідовності основ,які однаково читаються вперед і назад.Оскільки ланцюги ДНК володіють антипаралельним напрямком,то вважають,що послідовність є паліндром-ною,якщо вона ідентична,коли читається в напрямку від 5'-до3'-кінця на верхньому і 3'-до5'-кінця на нижньому ланцюгу.Рестриктази-це необхідний інструмент в генній інженерії для вирізання потрібних фрагментів(генів)з великих молекул ДНК.Оскільки відомо більше 100 ферментів рестрикції,то це дозволяє вибрати необхідні рестриктази і селективно вирізати фрагменти з вихідної ДНК.Особливістю рестриктаз є те,що вони продукують розрізи молекул на декілька фрагментів(рестриктів)ДНК уступів,в результаті чого в утворених кінцях один ланцюг довший за інший,утворює своєрідний хвіст.Такі кінці (хвости) отримали назву «липких» кінців,бо вони здатні до самокомплементарності.Слідом за рестриктазами ДНК з рестрикційної суміші виділяють рестрикційні ДНК-фрагменти(ДНК-рестрикти),які необхідні потім для об'єднання з вектором.Для виділення ДНК-рестриктів використовують електрофорез, оскільки за допомогою цього методу рестрикційну ДНК дуже легко фракціонувати. Після електрофорезу фрагменти виділяють за допомогою різних методів.На підставі результатів порівняння розмірів рестриктів однієї і тієї ж ДНК,отриманих за допомогою різних рестриктаз будують рестрикційні карти,на яких показують сайти рестрикції кожної з використаних рестриктаз.У практичному плані рестрикційні карти дозволяють визначити не тільки розміри рестриктів,але і з'ясувати розташування в молекулах ДНК локусів тих чи інших генів.Виділені після електрофорезу з агарозних гелів фрагменти ДНК(рестрикти)можна заздалегідь піддати секвенуванню,тобто визначити в них нуклеотидну послідовність.Для цього використовують хімічний та ферментативний методи секвенування.Хімічний метод заснований на отриманні мічених радіоактивним фосфором фрагментів і видаленні з цих фрагментів однієї з основ з наступним урахуванням результатів радіоавтографії генів,що містять ці фрагменти.Ферментативний метод заснований на тому,що в кінець аналізованого фрагмента вводять нуклеотид,який потім використовується у синтезі різних фрагментів in vitro,аналізованих на нуклеотидну послідовність електрофоретично.Для вивчення специфічних послідовностей нуклеотидів в молекулі ДНК використовують також гібридизацію ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК.Існують різноманітні методи з'єднання фрагментів у цілісну структуру.Фрагменти з липкими кінцями,які одержані за допомогою однієї рестриктази,можуть гібридизуватися один з одним або їх зшивають кінцевою дезоксинуклеотидилтрансферазою.Фрагменти з рівними кінцями з'єднують T-4-лігазою.Вдається також зшивати фрагменти фрагменти з рівними і липкими кінцями.Спочатку за допомогою ДНК-полімерази липкий кінець добудовується і стає рівним,а потім з'єднується з іншим T-4-лігазою.2.Синтез вектора.Вектор–молекула ДНК або РНК,яка здатна самостійно реплікуватись у клітинах та забезпечувати реплікацію вбудованого в неї гена.Векторами в генній інженерії служать плазміди,фаги,косміди.Плазміда–поза хромосомна молекула ДНК, яка здатна до автономної реплікації.Зустрічається найчастіше у бактерій,іноді в еукаріотів (Дріжджі пивні).Х-ною особливістю плазмід є трансмісивність,тобто здатність передаватися від одних бактеріальних клітин до інших.Останні роки активно вивчають і використовують плазміди,які зумовлюють стійкість бактерій до антибіотиків(R-плазміди,резистентні).Вони містять генетичну інформацію,що забезпечує синтез продуктів,які пригнічують дію антибіотиків.Найчастіше для створення рекомбінантних гібридних молекул використовують плазміди,які мають лише одну ділянку дії для певної рестриктази.У плазміду можна вставити фрагмент чужої ДНК розміром не більше15 тис.пар нуклеотидів.З цією метою розрізані певною рестриктазою плазміди і фрагменти ДНК донора змішуються і під дією лігази зшиваються у кільцеву структуру–рекомбінантну ДНК.Рекомбінантні молекули так само,як і вихідні плазміди,під час введення їх у клітину реплікуються і передаються дочірнім клітинам.Внаслідок трансформації реципієнтні клітини набувають певних ознак донора.Для отримання рекомбінантних молекул з великими розмірами вставок (до 23 тис.пар нуклеотидів)як вектор використовують ДНК фага λ.Вона має два місця дії рестриктази.Кінцеві ділянки,які вона відрізає,містять інформацію для розмноження фага.Серединну частину λ-фага вирізають і на її місце вставляють фрагмент чужої ДНК,об'єднуючи її з кінцевими ділянками фагової ДНК. Зшивання фрагментів здійснює лігаза.Рекомбінантна молекула упаковується у білкову оболонку і утв.зріла фагова частка,яка здатна до розмноження.Фаги,які містять рекомбінантну молекулу ДНК,вводяться в бактерію.Рекомбінантна ДНК інтегрується з бактеріальною хромосомою і реплікується разом з нею.Вмонтований ген може проявлятися фенотипово.Для перенесення великих фрагментів ДНК (35-40 тис.пар нуклеотидів) використовують особливі вектори–косміди.Їх отримують об'єднанням невеликих фрагментів фага λ і плазмід.Косміди містять ділянку фага λ під назвою кос,яка відповідає за упаковку рекомбінантної ДНК у білкову оболонку,а також гени плазмід, які відповідають за їх реплікацію,та ген стійкості до тетрацикліну.Для введення синтезованих генів та фрагментів ДНК у клітини рослин використовують Ti-плазміду агробактерії (Agrobacterium tumefaciens),яка викликає пухлини у дводольних рослин.

У застосуванні до людини генна інженерія могла б застосовуватися для лікування спадкових хвороб.Однак,технічно,є істотна різниця між лікуванням самого пацієнта і зміною геному його нащадків.Завдання зміни геному дорослої людини дещо складніше,ніж виведення нових генноінженерних порід тварин,оскільки в даному випадку потрібно змінити геном численних клітин вже сформованого організму,а не однієї лише яйцеклітини-зародка.Для цього пропонується використовувати вірусні частки в якості вектора.Вірусні частинки здатні проникати в значний відсоток клітин дорослої людини,вбудовуючи в них свою спадкову інформацію;можливо контрольоване розмноження вірусних частинок в організмі.При цьому для зменшення побічних ефектів вчені намагаються уникати впровадження генноінженерних ДНК в клітини статевих органів,тим самим уникаючи впливу на майбутніх нащадків пацієнта.За допомогою генотерапіі в майбутньому можлива зміна генома людини.В даний час ефективні методи зміни геному людини знаходяться на стадії розробки і випробувань на приматах.Довгий час генетична інженерія мавп стикалася з серйозними труднощами,проте в 2009 році експерименти увінчалися успіхом:у журналі Nature з'явилася публікація про успішне застосування генноінженерних вірусних векторів для зцілення дорослого самця мавпи від дальтонізму.У цьому ж році дав потомство перший генетично модифікований примат (вирощений з модифікованої яйцеклітини)-ігрунка звичайна.Хоча і в невеликому масштабі,генна інженерія вже використовується для того,щоб дати шанс завагітніти жінкам з деякими різновидами безпліддя.Для цього використовують яйцеклітини здорової жінки.Дитина в результаті успадковує генотип від одного батька і двох матерів.Однак можливість внесення більш значних змін в геном людини стикається з низкою серйозних етичних проблем.