2.Типи поживних середовищ

Відомо дуже багато поживних середовищ для культивування мікроорганізмів (більше двох тисяч найменувань було класифіковано Левином і Шенлейна ще в 1930 р.), але число інгредієнтів, які є їх невід'ємними компонентами, відносно невелика. Проте якісний діапазон цих середовищ вельми широкий - від розчинів неорганічних солей, на яких можуть рости автотрофи, до складних поживних середовищ, що готується із м'ясних гідролізатів, збагачених кров'ю або сироваткою; ними звичайно користуються для виділення патогенних мікроорганізмів типу стрептококів, що відрізняються високою вимогливістю до складу живильної середовища. Розрізняють два основні типи поживних середовищ: так звані синтетичні середовища, головні складові частини яких точно відомі (наприклад, глюкозо-сольова живильна середа), і емпірично підібрані живильні середовища природного походження, склад яких точно невідомий (до них відносяться пептони, що готуються з частково гідролізованого білка).

Вибір живильного середовища залежить значною мірою від мети експерименту. Герберт наполегливо висловлювався за повсюдне використання синтетичних поживних середовищ. Проте слід визнати, що вони мають ряд практичних незручностей. Мікроорганізми, вирощені на таких живильних середовищах, звичайно фенотипно відрізняються від вирощених на поживних середовищах природного походження типу бульйону (наприклад, за складом і за швидкістю поділу). Розмноження мікроорганізмів на таких середовищах зазвичай легше пригнічується надлишкової аерацією або токсичними катіонами; вони також більш чутливі до порушень балансу між деякими складовими частинами живильного середовища, особливо амінокислотами. Багато бактерій мають потребу у великій числі факторів зростання, і для деяких з них до цих пір не знайдені штучні середовища, на яких вони могли б розмножуватися. Можливо, що всі ці незручності з часом будуть подолані, але поки середовища невідомого складу типу бульйонів, приготованих з перевар, використовуються досить широко, хоча вони і вносять в експеримент неконтрольовані фактори.

До складу середовищ, що застосовуються для вирощування бактерій, входять необхідні для побудови білків цитоплазми елементи: азот, вуглець, водень, кисень, неорганічні сполуки, що містять фосфор, калій, сірку, натрій, магній, залізо, мікроелементи: кобальт, йод, марганець, бор , цинк, молібден, мідь та ін Всі перераховані елементи повинні знаходитися в живильному середовищі в удобоусвояемую для даного мікроорганізму з'єднанні, причому вимоги різних мікробів в цьому відношенні неоднакові. Потреба в кисні і водні бактерії задовольняють головним чином за рахунок надходить у клітину води.

За характером засвоєння азоту патогенні мікроорганізми діляться наступним чином: одні з них витягують азот з простих амонійних сполук, інші потребують амінокислотах, треті розщеплюють високомолекулярні речовини - пептони, що представляють собою продукти неповного ферментативного перетравлення білків. Строго паразитичні види бактерій розмножуються тільки в присутності нативного, тобто незміненого, білка.

Джерелом вуглецю для патогенних бактерій є, головним чином, різні вуглеводи: цукор, багатоатомні спирти, органічні кислоти і їх солі. Потреба бактерій в неорганічних елементах задовольняється додаємо до живильному середовищі солями: NaCI, KH2PO4, K2HPO4 і т. д. Мікроелементи, що виконують роль каталізаторів хімічних процесів, необхідні в мізерно малих кількостях і надходять в живильне середовище з пептоном, неорганічними солями і водою.

Поряд з перерахованими органічними і неорганічними елементами бактерії потребують ростових факторах, які за своєю роллю відповідають вітамінам для тварин. Джерелом чинників зростання є додаються до живильному середовищі продукти рослинного і тваринного походження, що містять у своєму складі нікотинову, пантотенову, парабензойную кислоти, вітаміни А, В, С та ін

Живильні речовини можуть засвоюватися мікробами тільки при певній реакції живильного середовища, так як проникність оболонок мікробних клітин змінюється в залежності від рН середовища.Потреба в поживних речовинах і фізичних умовах у різних видів мікробів неоднакова і цим виключається можливість створення універсальної живильного середовища.

За консистенцією розрізняють щільні й рідкі поживні середовища. Щільні живильні середовища готують з рідких допомогою додавання до них клейових речовин - агару або желатину. Агар-агар (по малайски - желе) - продукт рослинного походження, що видобувається з морських водоростей. У воді агар-агар розчиняється при температурі 80-86 ° С, замерзаючі при 36-40 ° С. Застосування агарових середовищ завдяки їх здатності зберігати щільність при температурі 37 ° С дало можливість вирощувати патогенні мікроби при оптимальній для більшості з них температурі на щільних середовищах. Желатин - речовина білкової природи тваринного походження. У теплій воді при температурі 32-34 ° С він набухає і розчиняється, а при більш низькій температурі перетворюється в холодець. Однак при рН нижче 6,3 і вище 7,0 щільність желатину зменшується, і він погано застигає.

Вихідні продукти для приготування поживних середовищ. Для приготування поживних середовищ використовують:

· Продукти тваринного походження (м'ясо, казеїн, молоко, яйця, кров і т. д.).

· Продукти рослинного походження (картопля та ін.)

· Органічні і неорганічні сполуки визначеного хімічного складу.

Живильні середовища, приготовані з продуктів рослинного і тваринного походження, незважаючи на те, що вони не можуть бути стандартні і не мають певного хімічного складу, знаходять широке застосування в практиці мікробіології. Синтетичні живильні середовища, складені з хімічних сполук, використовують переважно для вивчення обміну речовин мікробної клітини.

Вимоги, що пред'являються до живильних середовищ. Живильні середовища повинні:

· Утримувати необхідні для харчування мікроба поживні речовини.

· Мати реакцію рН, оптимальну для вирощуваного виду мікроба.

· Мати достатню вологість, так як мікроби харчуються за законами дифузії і осмосу.

· Володіти ізотонічність.

· Бути стерильними, забезпечуючи тим самим можливість вирощування чистих культур мікробів.

Живильні середовища поділяються на середовища загального призначення і спеціальні.

До першої групи відносяться м'ясо-пептонний: агар, бульйон, поживний желатин. Середовища загального призначення використовують для вирощування багатьох патогенних мікробів і застосовують як основу для приготування спеціальних середовищ, додаючи до них кров, цукор, молоко, сироватку і інші інгредієнти, необхідні для розмноження того чи іншого виду мікроба.

До спеціальних живильним середах відносяться елективні (виборчі) і диференційно-днагностіческне.

Елективні (виборчі) середовища. Принцип створення елективних поживних середовищ заснований на задоволенні основних біохімічних і енергетичних потреб того виду мікроба, для культивування якого вони призначені. Певний склад і концентрація поживних мікроелементів, ростових факторів при строгому значенні рН забезпечують оптимальні умови для вирощування одного або декількох видів мікроорганізмів. При посіві на них матеріалу, що містить суміш різних мікроорганізмів, раніше всього буде проявлятися зростання того виду, для якого ця середу буде елективний.

Диференційно-діагностичні живильні середовища.

Диференційно-діагностичні живильні середовища використовують для визначення видової приналежності досліджуваного мікроба, грунтуючись на особливостях його обміну речовин. За своїм призначенням диференційно-діагностичні живильні середовища поділяються таким чином:

· Середовища для виявлення протеолітичної і гемолітичної здатності мікробів, що містять у своєму складі білкові речовини: кров, молоко, желатин, згорнуту кров'яну сироватку і т. д.

· Середовища з індиферентними хімічними речовинами, які служать джерелом живлення для одних видів мікробів і не засвоюються іншими видами.

· Середовища з вуглеводами і багатоатомними спиртами для виявлення відповідних ферментів.

· Середовища для визначення редукуючої здатності мікробів.

До складу диференційно-діагностичних середовищ, призначених для виявлення сахаролітичних і окислювально-відновних ферментів, вводять індикатори: нейтральний червоний, метиленовий синій, лакмусовий настойку, кислий фуксин, бромтимоловий синій, водний блакитний барвник і розоловую кислоту. Змінюючи своє забарвлення при різних значеннях рН, індикатор вказує на наявність або відсутність розщеплення, окислення або відновлення введеного в середу інгредієнта. Однак індикатор не є обов'язковою складовою частиною середовищ, призначених для виявлення ферментів. Так, наявність желатинази та інших протеолітичних ферментів в культурі визначають по розрідженню желатину, згорнутого яєчного або сироваткового білка.

Сухі поживні середовища.

Приготування поживних середовищ - один з найбільш відповідальних і важких ділянок роботи бактеріологічної лабораторії. У зв'язку з цим біопромишленності випускає стандартні, консервовані, сухі поживні середовища, різного призначення, для культивування мікроорганізмів.

Приготування звичайних поживних середовищ. Основою для приготування цих середовищ служить м'ясна вода, що містить екстрактивні речовини.

М'ясна вода.

1. 100 г свіжої яловичини або телятини звільняють від кісток, жиру і сухожиль, пропускають через м'ясорубку, фарш заливають 1 літром водопровідної води, добре розмішують. Залишають на добу в прохолодному місці або поміщають на 2:00 в термостат.

2. М'ясну пасту віджимають через марлю, кип'ятять протягом 5 хвилин. Для згортання білків дають охолонути. Фільтрують через ватяний фільтр, доливають водою до початкового об'єму. М'ясну воду розливають у флакони, стерилізують 20-30 хвилин при 120 ° С і зберігають у темному місці. Вона має вигляд прозорої жовтуватої рідини слабокислой реакції (рН 6,2-6,4), без білків. У м'ясний воді міститься невелика кількість амінокислот, солей, вуглеводів, факторів росту та екстрактивних речовин. Для приготування звичайних поживних середовищ до м'ясної води додають сухий пептон, який є первинним продуктом гідролізу білка і складається з суміші поліпептидів та амінокислот, отриманих шляхом пептичного або триптичного перетравлення.

На м'ясокомбінатах для виробництва сухого пептону використовують фібрин, кров та інші відходи. Сушать пептон в розпилювальної вакуум-сушарці.Рідкий пептон можна приготувати в лабораторних умовах шляхом пептичного перетравлення білків.

Пептон Мартена.

Свинячі шлунки (не промиті водою) з рясним слизовим шаром очищають від плівок, жиру і пропускають через м'ясорубку. До фаршу додають воду і соляну кислоту в наступному співвідношенні: фарш зі свинячих шлунків 250 г, вода водопровідна, нагріта до 50 ° С, 1000 мл, соляна кислота (питома вага 1,18) 10 мл. Суміш витримують у термостаті при 50 ° С. Через 24 години пептон прогрівають в автоклаві при 100 ° С і фільтрують, фільтрат подщелачивают 10% розчином NaOH до лужної реакції по лакмусу. Після цього фільтрат розливають в колби і стерилізують при 115 ° С 30 хвилин.

Для приготування бульйону пептон Мартена змішують з рівним об'ємом м'ясної води, встановлюють необхідну реакцію, кип'ятять 30 хвилин, фільтрують і стерилізують при 115 ° С 30 хвилин.

М'ясо можна переварювати за допомогою трипсину - перевар Хоттінгера, при цьому більш повно використовують білки м'яса, які розщеплюються до пептонов, поліпептидів і вільних амінокислот. При триптичного переварюванні м'яса отримують в 10 разів більше бульйону, ніж при звичайному методі

М'ясний перевар Хоттінгера.

М'ясо, звільнене від жиру і сухожиль, нарізають невеликими шматочками, поміщають в каструлю з киплячою водопровідною водою (в полуторному обсязі) і кип'ятять 15-20 хвилин, потім м'ясо витягують з рідини і пропускають через м'ясорубку. Встановивши рН охолодженої до 40-45 ° С рідини, що дорівнює 8, заливають нею фарш. До отриманої суміші додають сухий панкреатин у кількості 0,5-1% або підшлункову залозу з розрахунку 100 г залози на 1 л рідини. Потім суміш знову подщелачивают до рН 8 і розливають її в бутель. Туди ж додають 2-3% хлороформу і, закривши бутель гумовою пробкою, кілька разів струшують вміст. Бутель ставлять на 7-14 діб при температурі 37 ° С.

В результаті перетравлення м'ясний фарш перетворюється на гомогенний сіруватий осад, над яким знаходиться абсолютно прозора рідина солом'яно-жовтого кольору. Перевар Хоттінгера хорошої якості дає позитивну реакцію на триптофан і містить 560-860 мг% амінного азоту. Для приготування бульйону до 1 частини перевар додають 6-7 частин води.

Триптичного перевар.

Приготування бульйону з Переваров по Хоттінгера є більш економічним, ніж застосування мясопептонний середовищ; з одного і того ж кількості м'яса отримують бульйону в 5-10 разів більше. Крім того, можна використовувати для перетравлення замінники м'яса. Нарешті, присутність в переварить значної кількості амінокислот створює буферність, а отже, і велику стабільність рН середовища.

Перевар по Хоттінгера.

1кг м'яса, очищеного від жиру і сухожиль, нарізають шматками приблизно 1-2 см. М'ясо опускають невеликими порціями в каструлю з подвійною кількістю (по відношенню до м'яса) киплячій водопровідної води; кип'ятять 15-20 хвилин, поки м'ясо не стане сірим, що вказує на те, що білки згорнулися. М'ясо виймають шумівкою і пропускають його через м'ясорубку. Встановлюють в рідині рН 8,0. Опускають фарш в рідину і охолоджують до 40 ° у відкритій каструлі, потім додають підшлункову залозу (очищену від жиру, сполучної тканини і двічі пропущену через м'ясорубку) 1 в кількості 10% до взятої рідини (на 1 л рідини 100 г залози) або сухий панкреатин в кількості 0,5% і вище залежно від його активності. Добре розмішують, після чого знову подщелачивают суміш до рН 7,8-8,0 і повторюють таке подщелачивание через 30 хвилин. Відсутність зсуву реакції суміші в бік окислення вказує не недоброякісність ферменту. Після встановлення рН суміш переливають в бутель з щільною гумовою пробкою з таким розрахунком, щоб 1/3 бутлі залишалася вільною. Додають 1-3% хлороформу - 10-30 мл на 1 л рідини (в холодну пору року менше, ніж в тепле), закривають бутель пробкою і кілька разів струшують так, щоб хлороформ переміщувався від дна бутля до пробки і назад, після чого на хвилину виймають пробку для звільнення від надлишку парів хлороформу. Через 1-2 години після додавання ферменту знову перевіряють реакцію і встановлюють рН 7,4-7,6. При цій реакції залишають суміш для перетравлення на 7-10-16 днів при кімнатній температурі. Перші 3-4 дні перетравлення щодня перевіряють і виправляють реакцію. У ці дні також струшують перевар не менше 3 разів на добу. Надалі перевірку реакції виробляти недоцільно, а струшувати можна рідше; за 1-2 дні до закінчення перетравлення струшування зовсім припиняють, щоб перевар відстоявся.