5.Принцип безперервного культивування
Суть методу безперервного культивування бактерій і грибів полягає в тому, що вирощувана культура міститься у спеціальному приладі, в який постійно надходить свіже живильне середовище. З такою самою швидкістю з культиватора витікає культуральна рідина з мікробами. Безперервне культивування бактерій в культиваторах автоматично регулюється, а тому воно дуже перспективне, оскільки забезпечує значне збільшення продуктивності цехів при зменшенні затрат праці.
Отже, безперервне культивування мікробів широко використовується не тільки для вивчення їх фізіології, біохімії, генетики тощо, а й інтенсивно впроваджується в практику мікробіологічної промисловості. Нині розроблено низку варіантів проточного культивування різних мікроорганізмів: напівбезперервне, багатоциклічне та ін.
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним. Безперервна ферментація здійснюється в умовах сталого режиму, коли мікробна популяція і її продукти найбільш однорідні. Застосування безперервних процесів ферментації створює умови для ефективного регулювання й керування процесами біосинтезу. Системи безперервної ферментації можуть бути організовані за принципом повного витиснення або повного змішання. Перший приклад - так звана тубулярна культура .
Процес ферментації здійснюється в довгій трубі, у якій з одного кінця безупинно надходять живильні компоненти й інокулят, а з іншого з тією ж швидкістю випливає культуральна рідина. Дана система проточної ферментації є гетерогенною.
При безперервній ферментації у ферментах повного змішання (го-могенно-проточний спосіб) у всій масі ферментаційного апарата створюються однакові умови. Застосування таких систем ферментації дозволяє ефективно управляти окремими стадіями, а також всім біотехнологічним процесом і стабілізувати продуцент у практично будь-якому, необхідному експериментаторові або біотехнологу стані. Керування подібними установками здійснюється двома способами.
Турбидостатний спосіб базується на вимірі мутності потоку, який виходить. Вимір мутності мікробної суспензії, викликаний ростом кліток, є мірою швидкості росту, з якою мікроорганізми виходять із біореактора. Це дозволяє регулювати швидкість надходження у ферментер свіжого живильного середовища. Другий метод контролю, - хемостатний, простіше. Керування процесом у хемостаті здійснюється виміром не вихідного, а вхідного потоку. При цьому концентрацію одного з компонентів живильного середовища (вуглець, кисень, азот), що надходить у ферментер, установлюють на такому рівні, при якому інші живильні компоненти перебувають у надлишку, тобто концентрація, що лімітується біогенного елемента обмежує швидкість розмноження кліток у культурі.
Безперервний процес культивування мікроорганізмів має істотні переваги перед періодичним. Для безперервного (проточного) культивування, на відміну від періодичного, культури характерна постійна подача свіжих живильних компонентів зі швидкістю, рівною швидкості видалення середовища з культури (відкрита система). Якщо культура добре перемішується, то проби, узяті з будь-якої частини ферментера, будуть однакові по біомасі й концентрації субстрату. По складу вони ідентичні також культуральній рідини, що випливає з ферментера.
При безперервному культивуванні теоретично бактерії ростуть експоненціально в умовах постійної подачі свіжого середовища й видалення частини кліток разом зі старим середовищем, так що обсяг культури згодом не міняється.
Загалом кажучи, постійна концентрація кліток для безперервного культивування не обов'язкова. Однак у більшості робіт з вивчення кількісних аспектів безперервного культивування описуються системи з постійною концентрацією біомаси. Розглянуті нижче принципи відносяться тільки до безперервного культивування в рівноважному стані.
Термін "рівноважний стан" часто вживають у літературі у зв'язку з безперервним культивуванням; буквально він означає, що під час дослідження не відбувається зміни стану культури. Насправді це визначення занадто широке, оскільки на практиці при безперервному культивуванні деякі параметри можуть мінятися, тоді, як інші при цьому залишаються постійними. Тому безперервну культуру в рівноважному стані визначають як культуру з постійною концентрацією біомаси в певний період спостереження. На противагу цьому в періодичній культурі постійна концентрація розчиненого кисню підтримується змінами, що відбуваються в середовищі, але зміст у ній біомаси міняється.
Безперервне культивування в рівноважному стані можливо тільки в тому випадку, коли всі вступні потоки, необхідні для нагромадження біомаси, точно збалансовані з потоками, що беруть участь у виході біомаси із системи.
Теоретично обсяг чисто безперервної культури не міняється (на практиці він підданий незначним коливанням). Отже, швидкості подачі середовища у ферментер, і виходу культури з нього повинні бути однаковими. Нарешті, оскільки питома швидкість загибелі кліток майже завжди значно менше питомої швидкості їхнього росту, величину швидкості можна не брати до уваги. Виключення із цього правила спостерігається тільки при дуже низьких швидкостях росту мікроорганізмів, у присутності токсичних речовин або у випадку культивування в екстремальних біофізичних умовах.
Іншими словами, питома швидкість росту популяції у ферментері визначається швидкістю розведення D яка дорівнює p/y.
Існує багато типів безперервного культивування. В обговоренні ми обмежимося двома основними типами безперервного культивування: "хемостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом регулювання надходження субстратів, що лімітують ріст, і "турбидостатом", у якому стан рівноваги досягається шляхом видалення біомаси й заміщення її свіжим середовищем зі швидкістю, що відповідає росту культури.
Турбидостатний режим культивування
Турбидостатне культивування являє собою найпростішу систему безперервного культивування. Концентрація кліток при турбидостатному культивуванні регулюється постійним підстроюванням швидкості надходження живильних компонентів. Концентрацію біомаси в турбидостаті вибирає оператор, а швидкість розведення й концентрація субстратів підтримується так, щоб зберігався заданий рівень біомаси.
Принцип роботи турбидостата заснований на підтримці постійної щільності бактеріальної популяції в апараті, безперервна культура постійно перебуває в найбільш бажаній фазі росту, при якій забезпечується максимальний вихід біологічно важливих з'єднань або біомаси. Турбидостатне культивування здійснюють тоді, коли лімітований фактор не відомий або в ньому немає необхідності, тому субстрат додається у ферментер у надлишку. Надлишок всіх живильних компонентів середовища робить роботу турбидостата стабільною.
Турбидостат дозволяє регулювати систему в широких інтервалах концентрації біомаси при швидкостях розведення, близьких до Dкр. Швидкість розведення в турбидостаті дорівнює питомої швидкості росту за умови, що X залишається постійною величиною. Сигналом для подачі й регулювання швидкості потоку середовища може бути не тільки оптична щільність, але й будь-який параметр середовища, що піддається виміру електродом, що переводить величину вимірюваного параметра у величину електричного потенціалу.
Оскільки основні метаболічні функції (поглинання бактеріями кисню, виділення вуглекислого газу, зміна кислотності), тісно зв'язані зі швидкістю росту кліток і, в остаточному підсумку, з питомою швидкістю росту культури, саме ці показники частіше інших використають як вимірювані змінні при регулюванні потоку середовища.
Турбидостатне культивування може здійснюватися одностадійно й двустадійно, тобто в одному ферментері або двох послідовно з'єднаних між собою ферментерах.
Одностадійне турбидостатне культивування використається для одержання максимальної швидкості росту. При двустадійному турбидостатному культивуванні в другому ферментері, можливо, відтворити фазу росту, пов'язану із синтезом вторинних метаболітів (фазу стаціонарного максимуму).
При низьких концентраціях субстрату й при низькій концентрації кліток можна повернути у ферментер частину біомаси, що випливає з нього. Повернення підвищує концентрацію кліток і прискорюють процес. Варіантів повернення біомаси може бути кілька. Сепарують культуру, що випливає, і згущену частину повертають у ферментер. Установлюють різні фільтруючі пристрої, що дозволяють випливати культуральній рідини, але затримуючі клітки.
Турбидостатнмй режим культивування базується на прямому контролі концентрації біомаси. Найпоширенішим методом її визначення є вимір світорозсіювання за допомогою фотоелементів. Підвищення концентрації кліток і відповідно до оптичній щільності автоматично прискорює проток рідини й навпаки. По своїй конструкції турбидостати відрізняються від хемостатів лише системами контролю швидкості протоки. Хемостати застосовуються в процесах, що характеризуються малою протокою, коли концентрація кліток змінюється незначно зі зміною швидкості протоки, що полегшує саморегулювання системи.
Технічно найпростіший турбидостат відрізняється від хемостата тільки наявністю датчика оптичної щільності й виконавчого механізму (дозатора живильного) середовища, що включається при досягненні культурою заданої щільності. Оптична система дозволяє підтримувати стійкий режим при різниці щільності до й після розведення на рівні нижче 1% від заданої щільності, що дозволяє вважати динаміку щільності практично незмінною й користуватися диференціальними рівняннями для її формального опису.
Турбидостат являє собою систему культивування, що включає реактор, у який безупинно подається живильне середовище, з якого відбирається культура. Швидкості подачі середовища й відбору культури повинні бути рівні, що забезпечує сталість обсягу культури.
Один з найпростіших варіантів турбидостата з автоматичною підтримкою обсягу культури в реакторі зображений на схемі. Культиватор для вирощування складається з освітлюваного реактора (фотореактор), що барботирується газоповітряною сумішшю, що містить вуглекислий газ. Барботаж забезпечує перемішування культури, вуглецеве харчування кліток і відвід кисню. З ємності з живильним середовищем, з постійно заданою швидкістю, у реактор надходить середовище. Через отвір у реакторі, розташований на певній висоті, культура безупинно зливається в ємність для збору врожаю. Це забезпечує при постійній швидкості доливки сталість швидкості зливу і їхню рівність. Крім того, така система автоматично підтримує постійний обсяг культури у фотореакторі.
Synchronous culture - синхронна культура - культура, в якій клітинні цикли більшості клітин протікають синхронно.