8. Активный центр.

Активный (субстратный) центр– зто совокупность функциональных групп, расположенных в разных участках полипептидной цепи, но близко структурно и функционально ориентированных (в процессе укладки третичной структуры) и имеющих прямое отношение к катализу. Этот центр состоит из функциональных групп и радикалов:SH– (цистеин), - ОН (серин), - СООН (аспарагин), имидазольное кольцо гистидина и фенилаланина.

Активный центр включает в себя:

1) каталитический участок или центр, непосредственно взаимодействующий с субстратом, осуществляющий катализ;

2) контактная площадка, осуществляющая специфическое сродство фермента к субстрату и является местом фиксации субстрата к поверхности фермента;

3) включительные участки – карман, ложбинки.

Предполагается, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента на рибосомах, когда линейная однотипная структура полипептидной цепи превращается в трёхмерное тело строго определённой конфигурации, точнее активный центр формируется из функциональ – ных групп различных аминокислот.

Уолигомерных ферментов (имеющих четвертичную структуру) имеютсяцентры аллостерическойрегуляции– это участки связывания фермента с низким молекулярным веществом (эффектором или модификатором), имеющим иную, чем субстраты или продукт, структуру (АТФ, АДФ, НАД, промежуточные метаболиты.

Р

Каталитический центр

Р

Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной структуры и соответственно конфигурации активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. В связи с этим существует и два пространственно удалённых аллостерических центра: активации и ингибирования. Ферменты, активность которых контролируется состоянием как активного, так и аллостерического центров, называются аллостерическими ферментами.

9. Определение активности ферментов.

О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта. За единицу активности любого фермента (Е) принимают то количество фермента, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1мкмоля субстрата в 1мин. Существует и другая еденица активности:

1 катал - количество Е, которое катализирует превращение 1моль субстрата в 1 сек.

1 Е фермента = 16,67 нкатал.

Для выражения активности фермента используется определение удельной и молекулярной активности. Удельная активность- число Е ферменттивной активности в расчёте на 1мг белка. Чем выше степенб очистки фермента, тем выше удельная активность.Число оборотов фермента (молекулярная активность) - число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в 1 мин. Число оборотов широко варьирует, например:

1. Карбонгидраза (катализирует перенос Н₂СО₃) совершает 36000000 оборотов /мин

2. Каталаза (Н₂О₂---- О₂+ 2Н₂О₂) совершает 4000 оборотов / мин

3. Фосфоглюкомутаза – 1240 оборотов / мин

Для качественного обнаружения и количественного определения активности сложных ферментов используют следующие методы:

ЛДГ

Лактат ---------- ПВК

НАДНАД*Н₂+ Н

НАД*Н₂ интенсивно поглощает свет. По излучению ПВК можно судить о НАД*Н₂. На 1 молекулу лактата образуется 1 молекула НАД*Н₂.

НАД*Н₂интенсивно флюоресцирует. Интенсивность флюоресценции будет пропорциональна концентрации.