Вирусология общая Горячкиной

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

109

Применение. Реакция гемагглютинации ш ироко при­ меняется в вирусологической практике для обнаружения гемагглютинирующ их вирусов и их титрования. Реакция проста по технике выполнения, дает быстрые и достаточ­ но точные результаты . Наиболее часто РГА применяют при диагностике гриппа и других остры х респираторных вирусных инфекциях. И спользуют ее и для обнаружения ряда других вирусов, обладающ их гемагглютинирующ и- ми свойствами. В научных исследованиях РГА является удобной моделью для изучения механизма взаимодействия вируса и клетки.

Обычно реакцию гемагглютинации ставят на плексигла­ совых досках с углублениями — луночками, реже — в про­ бирках или на предметных стеклах.

Ниже приводится пример выявления вируса гриппа и определения его титра в вируссодерж ащ ем материале — аллантоисной ж идкости куриного эмбриона, зараженно­ го в аллантоисную полость смы вом из носоглотки больно­ го гриппом.

Т ехника пост ановки Р Г А (табл. 9). На плексигласо­ вой доске готовят двукратные возрастающ ие разведения в объеме 0,5 мл исследуемого вируссодерж ащ его материа­ ла, начиная с 1:10 и до 1:1280. В луночки с разведениями добавляют равные объемы 1% взвеси эритроцитов кур (предварительно трехкратно отмы ты х физиологическим раствором).

Д оску осторож но встряхиваю т и оставляю т на 3 0 - 45 мин при комнатной температуре. Учет результатов про­ водят по трехкрестовой системе в зависимости от внеш не­ го вида осадка эритроцитов.

При гемагглютинации на «+ + » осадок имеет форму зонтика и занимает все дно лунки. При отсутствии агглю ­ тинации эритроциты оседают в центре лунки в виде к ом ­ пактного диска.

Т ит ром вируса называется то наибольшее его разве­ дение, при котором еще наблюдается выраженная гемагглютинация («+ + + » или «++>>). В нашем примере титр

Таблица 9

Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа

Номера лунок разведения вируссодержащего материала

Ингредиенты РГА	1	2	3	4	5	6	7	8	j	9
(в мл)
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	j	К
Вируссодержащий									0,5
материал	0,1	0,5
								вылить
неразведенный
Физиологический	0,9	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5
раствор
1% взвесь эритроцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5
кур
Возможный результат	+++	Ч—	+++	+++	-f~j—|	++	+	—		—
						титр

Г л а ва 3 . М и о д ы и с с л ед о ва н и я в вирус о ло гии

111

вируса 1:320 (табл. 9). Количественное содержание виру­ са в разведении, равном титру, называется гем аглю т и- н и рую щ ей единицей (содерж ится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для по­ становки реакции т орм ож ения гем агглю т инации, в к о ­ торой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующ ие единицы.

Реакция т орм ож ения гем агглю т инации (Р Т Г А )

Как уже указывалось, гемагглютинирующими свойства­ ми обладают многие вирусы, что позволяет выявить их в реакции гемагглютинации, но не дает возмож ности их индентифицировать.

Однако, если предварительно соединить вирус со спе­ цифической иммунной вируснейтрализующ ией сы ворот­ кой и уж е потом добавить эритроциты , то такой инак­ тивированный вирус теряет способность вызывать гемаггл ю ти н ац и ю . Таким образом , ви русн ейтрал изую щ ая сыворотка оказывает тормозящ ее действие на реакцию ге­ магглютинации, и по отсутствию или наступлению РГА мож но судить о том, произош ла ли реакция нейтрализа­ ции меж ду вирусом и сы вороткой.

Эта реакция получила название реакции т орм ож ения гем агглю т инации (РТГА), она обладает иммунологичес­ кой специфичностью и мож ет бы ть использована: а) для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующ его вируса — по специфической диагностической сы воротке; б) для выявления титра неизвестных антител в сы воротке больного — по известным вирусным антиге­ намдиагностикумам.

И нгибит оры . Затрудняет применение РТГА наличие в

сы воротках крови человека	и ж ивотны х неспецифичес­
ких вирусны х ингибиторов,	которы е могут вызвать не­

специфическое торможение гемагглютинации. Чтобы из­ бежать искажения результатов РТГА, выпускают проти­ вовирусные диагностические сы воротки, освобожденные от ингибиторов.

1 1 2 Общ а я м ед и ц и н с к а я ви ру с о л о ги я

При постановке РТГА с сыворотками больных следует пользоваться специальными ингибиторорезистентны ми вирусными диагностикумами или же освобождать сы во­ ротки от ингибиторов путем прогревания при температу­ ре 5 6 -6 0 С, обработки нейраминидазой, трипсином, аце­ тоном, адсорбции ингибиторов каолином и т.п.

Реакцию торможения гемагглютинации ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА. Основ­ ное отличие состоит в том, что в реакции наряду с виру­ сом и эритроцитами участвует еще сыворотка, с которой вирус предварительно выдерж ивают, и уже потом добав­ ляют эритроциты .

Техника пост ановки Р Т Г А (табл. 10) с целью иденти­ фикации вируса гриппа рода А . На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающ их разведений (в объеме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сы вороток A(H 1N 1), A(H 2N 2) и A (H 3N 2) от 1:10 до 1:320 (до титра сы вороток). Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содерж ится 4 гемагглютинирующ ие еди­ ницы; доза была оттитрована в РГА (табл. 10). П осле выдерж ивания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляю т по 0,5 мл 1% взве­ си эритроцитов кур. Учет результатов проводят через 3 0 - 40 минут. В нашем примере торм ож ение гемагглю тина­

ции произош ло	с сы вороткой A (H 3N 2), следовательно,
вы делен ви рус	гриппа, п ри н адлеж ащ и й к п од ти п у
A (H 3N 2).
РТГА ставят и для определения наличия и титра анти­
тел в сы воротке	больного. Для этого готовят последова­

тельные двукратны е разведения сы воротки в объем е 0,25 мл и соединяют их с 0,25 мл известного антигена (содержащ его 4 гемагглютинирующ ие единицы), чтобы произошла нейтрализация вируса. Затем в пробирки вно­ сят по 0,5 мл взвеси эритроцитов. За титр сыворотки при­ нимают то наибольшее ее разведение, в котором еще на­ блюдается торможение гемагглютинации (1:160).

1 43 .Зак 5

Таблица 10

Схема постановки реакции торможения гемагглютинации для определения типовой

Ингредиенты РТГА в мл

Диагностические

противогриппозные сыворотки в разведении 1:5

Физиологический

раствор

Вируссодержащая алантоисная жидкость в разведении 1:40 (рабочая доза вируса)

Взвесь эритроцитов кур 1%

Возможный результат

Диагности- A(H1N1) ческие A(H2N2) сыворотки A(H3N2)

принадлежности вируса гриппа А

	Номера лунок, разведения иммунной сыворотки
1	2	3	4	5	6	7
1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	Конт.
0,25	0,25	0,25				0,25
					вылить
	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5
0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	—
	Выдерживание 1 час при комнатной температуре
0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
+++	+++	+++	+++	+++	++
+++	+++	+++	+++	+++	+++
					++

1и

114	Общ ая медицинская вирусология

Реакция нейтрализации вирусов in vivo (на мышах и куриных эмбрионах)

Реакция нейтрализации вирусов вы соко специфична, она применяется для идентификации вирусов, выявления антител, а также для титрования коммерческих препара­ тов противовирусных иммунных сы вороток и иммуногло­ булинов.

Реакция нейтрализации основана на способности им ­ мунной вируснейтрализующ ей сы воротки при контакте с вирусом подавлять его инфекционные свойства, что вы ­ является при введении смеси в чувствительную биологи­ ческую систему (мыш и, курины е эмбрионы, клеточная культура).

Мы уж е ознакомились с применением реакции нейтра­ лизации вирусов в клеточных культурах (нейтрализация ЦПД, задержка гомадсорбции, нейтрализация по цветной пробе — задержка образования бляш ек), а такие при п о­ становке реакции тормож ения гемагглютинации. Здесь рассматривается постановка этой реакции на мышах и к у ­ риных эмбрионах.

Основными составляющ ими компонентами этой реак­ ции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сы воротки одного и того же вида ж ивотного или человека; содержащ ий живые виру­ сы материал, являю щ ийся антигеном; биологические объекты (мыш и, куриные эмбрионы ), на которы х обнару­ живают вируснейтрализующ ее действие иммунной сы во­ ротки.

П рименяют два варианта постановки реакции нейтра­ лизации. При одном из них берут постоянную дозу сы во­ ротки и различные разведения вируса, при втором — п о­ стоянное разведение вируса и различные разведения сы ­ воротки.

Первый вариант использую т, когда необходимо уста ­ новить, при каком разведении вируса наступает нейтра­ лизующ ее действие сы воротки.

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

115

Второй вариант выявляет нарастание титра антител. В зависимости от задач исследования и свойств вируса м е­ тоды и объекты заражения и сама методика постановки реакции нейтрализации могут быть различными, однако это не меняет сущ ности реакции. Во всех случаях после­ довательность проведения реакций следующая:

1)предварительный контакт вируссодерж ащ его мате­ риала с соответствую щ ей иммунной сы вороткой (один из этих компонентов заведомо известен, на­ личие другого определяется);

2)введение этой смеси в чувствительную биологичес­ кую систему (белым мыш ам или куриным эм брио­ нам);

3)учет наличия или отсутствия нейтрализации.

Сы ворот ки , употребляемые для реакции нейтрализа­ ции, получают либо от больных людей (для обнаружения антител и нарастания их титра), либо применяют диагно­ стические сы воротки от иммунизированных ж ивотны х (для идентификации возбудителя).

Перед постановкой реакции сы воротки, как правило,

инактивирую т, прогревая при температуре 5 6 -6 0 °С.

А нт игены ( вируссодерж ащ ие взвеси) получают из ма­ териала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей зараженных вирусом ж ивотны х, кури ­ ных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением ан­ тиген титрую т для определения его активности.

Б иол огические объек т ы , употребляемые в реакции нейтрализации, являются той средой, в которой проявля­ ется нейтрализующ ее вирус действие иммунной сы ворот­ ки. П оэтому выбор того или иного объекта производится с учетом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования. В качестве биологических объектов используют лабора­ торных ж ивотны х, чаще всего белых мыш ей, куриные эмбрионы , а также культуры клеток.

При работе с вирусами необходимо учитывать их тро­ пизм, что позволяет значительно повысить чувствитель­

5*

1 1 6

Общ ая медицинская вирусология

ность реакции нейтрализации и выявлять ничтож ны е количества антител. М ожно вводить вирус и без учета его избирательных свойств к ткани, однако в этом случае надо выбирать объект более чувствительный к данному виру­ су, например новорожденных ж ивотны х.

Постановка реакции нейтрализации. Работа со все­ ми ингредиентами реакции нейтрализации и ее постанов­ ка проводится с соблюдением всех правил асептики.

I вариант. Чаще его ставят для идентификации выделен ного вируса. Для постановки реакции берут два ряда про­ бирок, из которы х первый ряд является опытным, а вто­ рой — контрольным.

В первый ряд пробирок наливают определенное количест­ во неразведенной диагностической иммунной сыворотки, во второй — контрольный — такое же количество неразве­ денной нормальной сыворотки того же вида ж ивотного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений виру­ са, чтобы при добавлении их в пробирки опытного конт­ рольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10~\ 10‘ 2, 10'3 и т.д.). Сыво­ ротки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объемах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 37 °С обы чно на 1 -2 часа. После этого опытные и конт­ рольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы .

Каждым разведением для достоверности опыта зара­ жают не менее 4 мышей или курины х эмбрионов.

Реакция нейтрализации на белых мышах (I варинт).

За зараженными животными (опытными и контрольны ­ ми) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, ре­ гистрирую т заболевших и погибш их мышей. Учет реак­ ции проводят путем сопоставления количества погибш их опытных и контрольных мыш ей от соответствующ его раз­ ведения вируса. Определяют 50% -ную смертельную дозу — LD50, проводя подсчет по Риду и Менчу. Высчитывают индекс нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

117

Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой ИН —---------------------------------------------------------------------------------------■

Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой

ИН менее 10 — отрицательный; ИН — 1 1 -4 9 — сомнительный;

ИН равный 50 и выше — полож ительный.

Реакция нейтрализации на куриных эмбрионах (I вариант). Подготовительная работа для этой реакции описана вы ш е. Введение смеси вируса с иммунной сы во­ роткой в куриные эмбрионы следует проводить, учиты ­ вая тропизм вируса. Так, вирус гриппа вводят в амниоти­ ческую или аллантоисную полость куриного эмбриона; ви­ рус герпеса, осповакцины наносят на хорионаллантоисную оболочку и т.д. Зараженные эмбрионы инкубируют при температуре 3 5 -3 7 °С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскры ва­ ю т, аллантоисную или амниотическую ж идкость отсасы ­ вают и в ней определяют наличие вируса при помощ и ре­ акции гемагглютинации. Если гемагглютинации наступила в контроле (смесь нормальной сы воротки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрали­ зующ им действием. Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путем статистической обработки.

II вариант (на мышах и куриных эмбрионах). Реак цию ставят с различными разведениями исследуемой сы ­ воротки и постоянной дозой известного ж ивого вируса. Для этого к двукратным возрастающ им разведениям сы ­ воротки добавляют равные объемы определенного разве­ дения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD50 вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть вы ­ держивают опытные и контрольные смеси 1 -2 часа в тер­ мостате, после чего вводят их мыш ам или куриным эм б­ рионам.

При постановке реакции нейтрализации на мыш ах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, даю ­ щее защ итный эффект у 50% мыш ей.

В реакции на куриных эмбрионах титром сы воротки считается то наибольшее ее разведение, которое еще сп о­

118	Общ ая медицинская вирусология

собно задерживать гемагглютинируюгцее действие виру­ сов у 50% зараженных куриных эмбрионов.

3.6. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций

К таким методам относятся молекулярная гибридиза­ ция и полимеразная цепная реакция, которые благодаря своей специфичности и чувствительности в последние годы получили ш ирокое распространение. Эти методы позво­ ляют обнаруж ить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов или бактерий (т.е. их ДНК или РНК с определенной нуклео­ тидной последовательностью), и тем самым доказать на­ личие соответствую щ ей инфекции.

Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)

Данный метод основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации. Денатурация — это расхождение цепей при нагревании ДНК до 8 0 -10 0 °С или обработке ее щелочью. Ренатурация — воссоединение це­ пей с помощ ью водородных связей при снижении темпе­ ратуры до 4 0 -6 0 “С (так называемый отж иг) и приобрете­ ние ДНК первоначальной двухспиральной структуры .

Разъединенные цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральны х ДНК, им ею щ их комплементарны е участки располож ения нуклетидов. К гибридизации комплементарных нитей способна такж е РНК, образуя комплексы ДНК — РНК или РНК — РНК .

Н еобходимые для молекулярной гибридизации фраг­ менты ДНК или РНК, с помощ ью которы х выявляют на­ личие в исследуемом материале комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, называются молекулярными зонда­ ми. Молекулярные зонды готовят из нуклеиновых кислот, выделенных из различных вирусов, иногда используют вирусную и-РНК, но чаще зондом служит клонированная