Уравнение Михаэлиса и Ментен графически – прямоугольная гипербола

Если мы простроим график зависимости скорости реакции Vот концентрации субстрата [S] мы получим кривую типа

Рис 2-6. График зависимости скорости реакции V от концентрации субстрата [S]

При низкой концентрации субстрата ( в области [S] < 0.1 Км, обозначено (1), рис 2-6), можно показать что

т. е., из уравнения Михаэлиса-Ментен вытекает, что v = k [S]; скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. Это – реакция первого порядка. Такая кинетика свидетельствует, что фермент не насыщается субстратом и некоторые ферменты свободны. Поэтому прибавление большего количества субстрата, приводит к образованию большего количества фермент-субстратного комплекса ES, который, распадаясь, дает большее количество продукта реакции P.

При высокой концентрации субстрата ( если [S] > 10 Км, обозначено 3, рис 2-6 )

Это значит, что скорость реакция стала независимой от концентрации субстрата. (реакция нулевого порядка), и это можно объяснить тем, что все молекулы фермента насыщены субстратом. Прибавление большего количества субстрата к раствору, не дает прироста ES и, поэтому, скорость не изменяется.

Зависимость в зонах между 1 и 3 на графике носит смешанный характер.

Из изложенного выше вытекает еще один важный вывод: если концентрация субстрата находится в пределах от 0.1 Km до 10 Km, ферменты используются эффективно без утраты контроля со стороны субстрата. В пределах этого диапазона, изменения концентрации субстрата отражаются на изменениях скорости реакции.

Каково физическое значениеKm? Уравнение Михаэлиса-Ментен можно преобразовать к такому виду

Из этого уравнения легко показать, что

при [S] =10 Km	v/Vmax = 0.91
при [S] = Km	v/ Vmax = 0.50
при [S] = 0.1 Km	v/ Vmax = 0.09

Т.е, Km = [S], если скорость реакции равна половине от максимальной скорости и, значит, выражается в единицах концентрации. При условии, что k3 << k2, константа Михаэлиса становится хорошим показателем сродства фермента к субстрату. Чем выше значение Км, т.е., чем выше должна быть концентрация субстрата для достижения Vmax, тем ниже это сродство и наоборот.

Значение Km дает также некоторые представления относительно эффективности катализа и регуляции. Если [S]>> 10 Km, реакция является эффективной («работают» все молекулы фермента), но реакция утрачивает способность к регуляции количеством субстрата. Если [S] << 0.1 Km, эффективность реакции низка, но имеется хорошее управление скоростью реакции путем изменения концентрации субстрата. Наиболее удобное сочетание эффективности и контроля соблюдается при условии, если концентрация субстрата одного порядка со значениями Km. Эти выводы имеют важное прикладное значение. Если Вы отлаживаете исследование фермента или в клинической лаборатории или исследовательской лаборатории, следует насыщать фермент субстратом. Знание Км позволит Вам оценивать концентрацию субстрата, необходимую для гарантии насыщения. Эта концентрация должна быть равна по крайней мере двум Км. В физиологических условиях, для эффективной работы концентрация субстрата должна быть на уровне Км этого фермента, но если важно управление концентрацией субстрата, концентрация субстрата должна быть в диапазоне ниже 5 Км.

Практически рассчитать значения Км и Vmax, пользуясь кривой, описываемой уравнением Михаэлис и Ментен сложно. Более удобно оказалось определять эти параметры в координатах “двойных обратных величин”. Формула уравнения Михаэлиса в этом случае приобретает следующий вид

а зависимость - вид прямой линии (график Лайнуивера-Берка).

Рис.2-7. График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Метод «двойных обратных величин»(график Лайнуивера-Берка).

Такой способ выражения позволяет более точно рассчитать значения Км и V. Пересечение линии с осью 1/[S] позволяет вычислить значение Км, а пересечение с осью 1/V – значение максимальной скорости.

Уравнение Михаэлиса и Ментен позволяет рассчитать эффективность работы фермента

Kcat или число оборота. Как показано выше, для всех катализируемых ферментами реакций максимальная скорость достигается при полном насыщении ферментов субстратом, тогда [ES] = [Et] и

по этой причине, k₃ (которую также называют k_cat при полном насыщении субстратом) рассматривают как число оборота, и

Уравнение 1

Число оборотов выражается максимальным числом молекул субстрата, которые могут быть преобразованы в продукт в единицу времени (обычно за секунду) одной молекулой фермента. Эта характеристика фермента связана со значением kcat. kcat включает константы скорости всех реакций между ES и E + P в многошаговом ферментном процессе. Kcat - своеобразная мера образования продукта при оптимальных условиях (насыщенный субстратом фермент). Единица измерения kcat - сек^-1. Величину, обратную kcat можно рассматривать как время, необходимое одной молекуле фермента для превращения одной молекулы субстрата в продукт или альтернативно, kcat отражает число молекул субстрата катализируемых молекулой фермента за секунду т.е. число оборота

Большинство ферментов имеет число оборотов в пределах 1 - 10⁴сек^-1. Каталаза, катализирующая реакцию (), имеет одно из самых высоких известных чисел оборота, 1x10⁷. С другой стороны, лизоцим использует две (2) секунды для преобразования молекулы субстрата в продукт.

Если концентрация субстрата [S] низкая, то [E][Et]

Поэтому, при низкой концентрации субстрата [S], из уравнения 1 и уравнения Михаэлиса-Ментен вытекает, что если

Если теперь взять фермент и два различных субстрата А и Bто при одной и той же концентрации фермента в обеих реакциях, можно показать что

Здесь отношение kcat/KM подобно константе скорости реакции второго порядка для реакции между свободным ферментом и субстратом. Оно важно для оценки взаимодействия фермента и субстрата при условии избытка активных центров связывания субстрата, что позволяет непосредственно сравнивать эффективность действия фермента при взаимодействии с различными субстратами. Следующая таблица показывает значение kcat/KM для различных субстратов химотрипсина. Как видно эффективность фермента к указанным субстратам колеблется в очень широких пределах (для Гли и Фен различия достигают примерно 1 миллиона, объясняя специфичность этого фермента).

Табл 2-2. Значения kcat/Kmдля различных субстратов химотрипсина
Аминокислота в субстрате	Боковая цепь аминокислоты	Kcat/Km[(моль/л)-1сек-1]
Глицин	-Н	1.3х10^-1
Валин	-СН2-СН2-СН3	3.6х10^2
Лейцин	-СН2-СН2-СН2-СН3	3.0х10^3
Фенилаланин	-СН2-ФЕНИЛ	1.0х10^5

Максимально высокое значение kcat/KM, которое определяется частотой столкновений субстрата и фермента, будет зависеть от скорости диффузии реагирующих веществ в растворе. Такого рода реакции называют ограничиваемыми диффузией реакциями. При условии, что каждое столкновение приводит к образованию фермент-субстратного комплекса, диффузионная теория предсказывает, что верхний предел kcat/KM , как проявление высшего совершенства ферментативной реакции, может достигать значений порядка 10⁸ - 10⁹ (моль/л)^-1 сек^-1. Субстрат не может перемещаться к ферменту быстрее. Такие ферменты как карбангидраза, фумараза и триозофосфатизомераза фактически приближаются к этому пределу. Их каталитическая скорость ограничена только скоростью, с которой они сталкиваются с субстратом в растворе. Любое дальнейшее увеличение в скорости может быть достигнуто только при условии уменьшения времени диффузии. Действительно, многие ферменты в клетке связаны в организованные ансамбли, в которых продукт одного фермента очень быстро находится следующим ферментом. Фактически, продукт переходит от одного фермента к другому подобно конвейерной линии.

Ниже приводятся серия значений Км,kcat и kcat/Km, которые позволят представить диапазоны этих величин.

. Значения Км, kcat и отношение Кcat/Км показаны в табл 2-3.

Табл 2-3. Значения Км, kcat и отношение Кcat/Км для разных ферментов.

Фермент	Субстрат	Км (М/л)	kcat (сек^-1 )	Kcat/Km (М/л)^-1 сек^-1
Ацетилхолинэстераза	Ацетилхоллин	9.5х10^-5	1.4х10^4	1.5х10^8
Карбангидраза	СО2	1.2 х 10^-2	1.0х10^6	8.3х10^7
	НСО3	2.6 х10^-2	4 х10^5	1.5 х10^7
Каталаза	Н2О2	2.5х10^2	1.0х10^7	4.0х10^8
Химотрипсин	Этиловый эфир N-ацетилГли	4.4х10^-1	5.1х10^-2	1.2х10^-1
	Этиловый эфир N-ацетилВал	8.8х10^-2	1.7х10^-1	1.9
	Этиловый эфир N-ацетилТир	6.6х10^-4	1.9х10^2	2.9х10^5
Фумараза	Фумарат	5 х10^-6	8 х10^2	1.6 х10^8
	Малат	2.5 х10^-5	9.0 х10^2	3.6 х10^7
Рибонуклеаза	РНК	7.9 х10^-3	7.9х10^2	1.0 х10^5