Методи Біохімічних досліджень
Біохімічні дослідження останнім часом все більше наближаються до розв’язання питань про внутрішні механізми регуляції в живій клітині, до вивчення молекулярних особливостей біохімічних процесів. У зв’язку з цим поступово ускладнюються методи та прилади, що використовуються у цій галузі науки.
Центрифугування. Цей метод полягає в розділенні неоднорідних систем (суспензій, емульсій) в полі дії доцентрових сил. Під дією цих сил суспензії розділяються на тверду фазу – осад і рідку – центрифугат, який ще називають супернатантом або надосадовою рідиною. Розрізняють препаративне й аналітичне центрифугування.
У біохімічних дослідженнях препаративне центрифугування використовують для очищення та фракціонування біологічного матеріалу – субклітинних органел, окремих макромолекул (ДНК, мітохондрій, білків тощо) з метою вивчення їх структури та біологічної активності. Окремі фракції, одержані при центрифугуванні та фракціонуванні вмісту пробірок, потім аналізують за радіоактивністю, ферментативною активністю, флюоресценцією, адсорбцією, детектують за допомогою хімічних тестів.
Центрифугування дозволяє визначати абсолютні величини молекулярних мас макромолекул і служить для оцінки гетерогенності суміші. Цей метод застосовують для розділення молекул ДНК різної щільності, ліпопротеїнів плазми крові, білків, їх комплексів, мультиферментів. У клінічній практиці центрифугування використовують для визначення холестерину та фосфоліпідів сироватки крові, глюкози крові, залишкового азоту крові, креатиніну й сечової кислоти в сироватці крові та сечі тощо.
Оптичні методи дослідження. Ці методи належать до найпоширеніших у біохімії. Вони дають можливість одержати різнобічну інформацію, і, першою чергою, ідентифікувати речовини, визначити їх кількість, встановити структуру біологічно активних сполук, а також вивчити механізми біохімічних реакцій.
Фотоколориметрія– це вимірювання поглинання видимої частини спектру забарвленими розчинами. Для наукових досліджень фотоколориметрія застосовується при визначенні активності ферменту супероксиддисмутази, загальної антиоксидантної активності плазми крові та еритроцитів, гідропероксидів ліпідів плазми крові, серомукоїдів сироватки крові тощо. У клінічній практиці цей метод використовують для кількісного визначення піровиноградної кислоти й холестерину крові, активності креатинкінази, лужної та кислої фосфатаз, гаптоглобіну крові, визначення сечовини, сіалових кислот, тригліцеридів крові тощо.
Власне спектрофотометрія – це вимірювання поглинання (і пропускання) прозорих розчинів в ультрафіолетовій, видимій та інфрачервоній зонах спектру (220 – 1 100 нм).
Прилади, принцип роботи яких грунтується на вимірюванні світлопоглинання речовин, називають абсорбціометрами. До них належать фотоелектроколориметри (ФЕК) і спектрофотометри (СФ). Фотоелектроколориметри дають змогу проводити вимірювання в видимій частині спектра, тоді як спектрофотометри (СФ) – проводити вимірювання в широкому діапазоні хвиль від ультрафіолетового до інфрачервоного (210 – 1 100 нм) і досліджувати забарвлені та безбарвні розчини у вузькій частині спектра, у зоні максимального поглинання монохроматичного потоку світла.
При вимірюваннях інтенсивності поглинання світлового потоку користуються величиною, яку називають оптичною густиною розчину.
Спектрометрія білків. Ознакою хромофорних груп білків, які визначають поглинання їх у видимій та УФ-частинах спектру є наявність пептидного зв’язку та залишків ароматичних амінокислот. Наявність цього зв’язку в білках спричинює поглинання світла при 190 нм (УФ-частина спектру). При конформаційних перебудовах білків атоми, які утворюють пептидний зв’язок, змінюють свою взаємодію, що спричинює зміни спектра поглинання, виникнення гіпохромного ефекту.
Ароматичні амінокислоти (триптофан, тирозин і фенілаланін) є основними структурними компонентами білків, які визначають поглинання їх при довжині хвилі понад 220 нм. Певну роль у процесі поглинання білків відіграють гістидин і сірковмісні амінокислоти.
Спектрометрія нуклеотидів і нуклеїнових кислот.Азотисті основи, нуклеозиди, нуклеотиди та нуклеїнові кислоти поглинають ультрафіолетове світло. Азотисті основи (пурини та піримідини) містять систему делокалізованих π-електронів, а також мають у складі своїх кілець атоми азоту, в яких є неподілена пара р-електронів. Слід відзначити, що спектри поглинання азотистих основ залежать також від їх таутомерної форми, йонізації груп, які входять до цих основ.
Використання спектрометрії у видимій та УФ-частинах спектру для біохімічних досліджень значно ширше, ніж наведено вище. Подібно до білків і нуклеїнових кислот вивчають вуглеводи, ліпіди, вітаміни та їх похідні. Широко застосовують спектрометричні методи для визначення вмісту й активності ферментів. Якщо субстрат або продукт ферментативної реакції має характерний спектр поглинання, то можна визначити кількість фермента в суміші, а за спектральними змінами хромофору в ході реакції дослідити кінетику цієї реакції. У клінічній практиці спектрофотометрія використовується для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі, для визначення активності амінотрансфераз сироватки крові, активності каталази еритроцитів.
Мас-спектрометрія дозволяє одержати інформацію про структуру молекул і, таким чином, ідентифікувати речовину, що досліджується.
В основі цього методу лежить явище іонізації речовини, внаслідок чого поряд із іонами вихідної сполуки утворюються іонізовані „уламки” меншої молекулярної маси. У біохімічних дослідженнях мас-спектрометри об’єднують із газорідинними хроматографами. Після розділення суміші на хроматографі та видалення газу – носія, досліджувана сполука потрапляє в мас-спектрометр. У біохімії мас-спектрометрію використовують здебільшого для визначення послідовності амінокислот у білках, для визначення структури молекул та ідентифікації речовин.
Нефелометрія – це метод аналізу, пов’язаний із оцінкою ступеня каламутності досліджуваного розчину. Інтенсивність розсіювання залежить від розмірів частинок і кількості розчиненої речовини. Цим методом можна визначити кількість білка в біологічному середовищі за ступенем помутніння, яке спричинюють реактиви. Всі нефелометричні методи у клінічній біохімії відносяться до турбидіметрії. Наприклад, тимолова проба, визначення серомукоїдів, бета-ліпопротеїнів тощо. Емісійна фотометрія грунтується на вимірюванні енергії, яка випромінюється досліджуваною речовиною в результаті енергетично збудженого стану. До методів емісійної фотометрії відносять спектрофлюорометрію, імунофлюоресценцію та полум’яну фотометрію. Явище випромінювання квантів енергії збудженою молекулою отримало назву люмінесценції. У випадку, коли молекула збуджується світлом, говорять про явище флюоресценції.
Спектрофлюориметрія базується на ефекті флюоресценції, який виникає в результаті енергетичного збудження досліджуваної речовини під впливом короткохвильового опромінення.
Основними напрямками її застосування є:
якісний аналіз досліджуваних речовин: одержання та порівняння спектрів флюоресценції дозволяє вивчати структуру та просторову організацію молекул та їх комплексів, а також ідентифікувати сполуки;
кількісний аналіз: визначення вмісту досліджуваних сполук у складі молекул, надмолекулярних утворах тощо
дослідження механізмів ферментативних реакцій.
Спектрофлюориметрію використовують у клінічних дослідженнях для визначення концентрацій складних органічних речовин – амінокислот, білків, нуклеїнових кислот, вітамінів (В2, А, Е), гормонів, адреналіну, серотоніну, гістаміну, визначення малонового діальдегіду крові тощо.
Імунофлюоресценція – зручний метод аналізу багатьох зразків на вміст та ідентифікацію специфічних антитіл. Широкого застосування набув метод імунофлюоресценції в наукових дослідженнях для оцінки клітин і зразків тканин.
Полум’яна фотометрія. В якості енергетичного агента, що викликає стан збудження досліджуваного речовини, використовують полум’я газової горілки. Іони металів забарвлюють полум’я у відповідності з характерними для них спектрами випромінювання. Цей метод дослідження можна використовувати у клінічній практиці для одночасного визначення концентрації натрію та калію (іноді й кальцію, літію) у біологічному матеріалі.
Явище „холодного світіння” деяких речовин, що зумовлене зміною електронного стану молекул або атомів, називають люмінесценцією. Люмінесцентний аналіз, в основі якого лежить флюоресценція, має широке застосування.
Вимірювання інтенсивності флюоресценції залежить від концентрації речовин, що дає змогу проводити кількісне їх визначення на приладах – флюориметрах. В якості джерела збудження в дослідженнях використовують ультрафіолетове випромінювання.
Для визначення активності НАДН2-оксидоредуктаз використовують біохемілюмінесцентний метод, який дає можливість оцінити зміни вмісту речовин реакційної суміші в динаміці розвитку ферментатичного процесу. Застосовується для визначення загальної антиоксидантної активності плазми крові тощо.
Атомна абсорбціометрія грунтується на вимірюванні поглинання монохроматичного світлового потоку атомами речовини, яка знаходиться в розжареному стані, що дозволяє визначити вміст атомів (іонів) металів (чисельних мікроелементів) у досліджуваних середовищах (біологічних рідинах, екстрактах із продуктів харчування, стічних водах тощо). За допомогою цього методу можна визначити понад 20 хімічних елементів (особливо важких металів), коли їх частка в зразку не перевищує 10-6.
Електронний парамагнітний резонанс (ЕПР) використовують для дослідження речовин, які мають парамагнітні властивості. До таких речовин належать іони перехідних металів та їх комплекси, вільні радикали, сполуки в збудженому стані, тобто такі, атоми яких мають неспарені електрони. Електрони мають електричний заряд і механічний момент обертання (спін) і тому поводяться як магніти, тобто їм притаманний магнітний момент. У зовнішньому магнітному полі магнітні моменти електронів можуть бути орієнтовані в напрямі поля (паралельно) або проти цього (антипаралельно). Паралельна орієнтація відповідає нижчому енергетичному стану порівняно з антипаралельною. Перехід електронів у виший енергетичний стан супроводжується поглинанням кванта електромагнітного випромінювання. У магнітному полі енергія поглинається в мікрохвильовому діапазоні, це явище отримало назву електронного парамагнітного резонансу.
У наукових біохімічних дослідженнях ЕПР-спектроскопія набула широкого застосування при вивченні металомістких біологічних речовин. Наприклад, ксантиноксидаза містить молібден, цитохромоксидаза – мідь, яка не входить до складу гему, негемові залізопротеїни – залізо. В окисненому стані вони здатні поглинати мікрохвильове випромінювання, що дає характерні ЕПР-піки. Поява або зникнення цих сигналів дозволяє вивчати механізми функціонування досліджуваних сполук, їх біологічну роль.
Використання цього методу дало можливість вивчити механізми дії низки мембранозв’язаних ферментів із використанням аналогів субстратів (Н+-АТФази мітохондрій, Са2+-, Мg2+-АТФази саркоплазматичного ретикулуму тощо), що не гідролізуються.
Ядерний магнітний резонанс (ЯМР) дає можливість визначати атоми, ядра яких мають магнітний момент. Як правило, це атоми, які містять непарне число електронів. Більшість атомних ядер мають власний механічний момент обертання, який пропорційний величині, що має назву ядерний спін. Магнітні моменти ядер за відсутності зовнішнього магнітного поля повністю розупорядковані. Якщо ж прикласти постійне магнітне поле, то елементарні магнітики ядер будуть орієнтуватися паралельно, або антипаралельно полю. Переорієнтація магнітного моменту ядра з паралельної орієнтації до антипаралельної супроводжується резонансним поглинанням електромагнітних хвиль.
У біохімічних дослідженнях метод ЯМР є, в першу чергу, аналітичним методом, за допомогою якого встановлюють структуру сполук, одержують інформацію про просторове розташування атомів, а також про конфігурацію молекул і молекулярних комплексів. Ця інформація дає можливість визначити, наприклад, шляхи протікання біохімічних реакцій, внести суттєвий внесок у з’ясування механізмів ферментатичних реакцій, визначення вторинної та третинної структури речовин. Останнім часом інтенсивно розвивається ЯМР-спектроскопія in vivo, в умовах близьких до фізіологічних. Об’єктом досліджень є органели клітин, окремі клітини, цілі органи і навіть організми. В медицині почала широко використовуватися ЯМР- томографія.
Електрофорез – це метод розділення заряджених частинок у електричному полі. У даний час метод електрофорезу широко використовують для фракціонування білків і ліпопротеїнів.
При електрофорезі на папері в здорової людини виявляють 5 білкових фракцій (альбуміни, 1-, 2-, , -глобуліни), при електрофорезі на агаровому гелі – 7 – 8, на поліакриламідному – 16 – 17 фракцій. Електрофоретичний розподіл білків широко використовують для діагностики захворювань, він дозволяє виділити із сироватки крові їх окремі фракції.
Електрофорез у поліакриламідному гелі широко застосовують у клінічній практиці. За його допомогою можна розділити білки сироватки крові на 20 фракцій, тому що їх розподіл залежить не лише від заряду, а й від розмірів і форми білкових молекул.
Ізоелектричне фокусування (ІЕФ)– один з найефективніших і широко розповсюджених методів фракціонування та очищення білків проводять на колонці або в тонкому шарі з градієнтом рН. Електричне поле впливає на молекули, що спричинює міграцію їх уздовж поля в напрямку до анода або катода залежно від знака електричного заряду кожної молекули. Швидкість міграції молекул пропорційна напруженості електричного поля і електрофоретичній рухливості подібно до того, як це відбувається при фронтальному електрофорезі, однак при ізоелектричному фокусуванні відбувається ще додаткове розділення в градієнті рН.
Суміш білків, які підлягають розділенню, вносять у колонку або наносять на пластину, заповнену електропровідною рідиною. Метод ІЕФ використовують не тільки для розділення, але й для визначення ізоелектричних точок білків. Виявлення білків після їх розділення ізоелектричним фокусуванням проводять тими ж методами, які використовуються після звичайного гель-електрофорезу, - забарвленням спеціальними барвниками з урахуванням того, що амфоліти здатні утворювати з ними комплекси.
Імуноелектрофорез належить до сучасних методів імунологічного аналізу, який включає поєднання електрофоретичного та імунологічного фракціонування білків. Принцип методу полягає в тому, що спочатку проводять електрофоретичне розділення суміші білків, а потім виявляють компоненти, які здатні давати реакцію преципітації з специфічними антитілами, тобто, головним чином, білки та вуглеводи. Забарвлені білки визначають скануванням у видимій або ультрафіолетовій частині спектру.
Метод імуноелектрофорезу в клінічній практиці дає можливість точно визначити компоненти складних білкових сумішей за їх імунологічною специфічністю та електрофоретичною рухливістю.
Хроматографічні методи. Для розділення та кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів використовують різні методи хроматографії, найважливішими з яких є:
адсорбційна хроматографія, яка базується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи інших сорбентах;
іонообмінна – базується на різній здатності речовин, які розділяють, до іонного обміну з тим або іншим іонітом. Іонообмінну хроматографію використовують в амінокислотних аналізаторах для визначення окремих амінокислот;
високоефективну рідинну хроматографію широко використовують у фармакології при синтезі та визначенні лікарських засобів, у клінічній біохімії для визначення біологічно активних речовин у фізіологічних рідинах; у біотехнологічних процесах і виробництвах.
розподільна; базується на різній розчинності речовин, які розділяють, у двох рідинах, що частково змішуються;
дифузна; базується на розділенні речовин за швидкістю дифузії всередину сорбента (гель-фільтраційна хроматографія, при якій розділення речовин ґрунтується на механічному явищі молекулярного просіювання;
хроматографія за спорідненістю (афінна хроматографія) – високоспецифічний метод розділення різних сполук; базується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, що мають спорідненість до речовин, які розділяють.
Хроматографічні методи дослідження застосовують у фармацевтичній промисловості для розділення та очищення антибіотиків, пептидів, гормонів, амінокислот, нуклеїнових кислот, для очищення речовин від домішок, концентрування та розділення сумішей. Для наукових цілей хроматографія застосовується для дослідження механізмів ферментатичних реакцій, виявлення проміжних стадій метаболізму, розділення жирних кислот, спиртів, складних ефірів, амінів. За допомогою цього методу можна розділити будь-які радіоактивні ізотопи.
Гель-фільтрація ґрунтується на здатності розділяти речовини залежно від їх розмірів, молекулярної маси та форми молекул (рис.1). Принцип цього методу полягає в тому, що молекули різних розмірів і форм здатні дифундувати в гелі з різною швидкістю. Для гель-фільтрації використовують як природні полімери (декстран, агарозу), так і синтетичні (акриламід, полістирол, хлор-бутиловий каучук). Сферичні декстранові гелі з високим ступенем гідрофільності, які складаються з полісахаридних ланцюгів, що побудовані з залишків глюкози отримали назву сефадексів. Для гель-фільтрації використовують також біогелі серії А на агарозній матриці.
Рис. 1. Схема гель-фільтрації на колонці з седафексом: великі кола з хрестиками – зерна седафексу; чорні кола, трикутники та прямокутники – білки з різною молекулярною масою; А – колонка на початку роботи; Б, В, Г – колонки в різні періоди роботи. На графіку нижче – розділення білкових компонентів
Метод гель-фільтрації використовують у фармацевтичній промисловості для розділення, визначення молекулярних мас та перевірки чистоти високомолекулярних гідрофільних сполук – білків, пептидів, глікопептидів, ферментів, нуклеїнових кислот тощо.
Електрохімічні методи. Ці методи грунтуються на вивченні явищ, які відбуваються на електродах або в міжелектродному просторі. В електрохімічних методах дослідження використовують вимірювання залежності сили струму в розчині від прикладеного до електроду потенціалу (полярографія); вимірювання величин рівноважних електродних потенціалів, або залежність потенціалу електрода від складу розчину (потенціометрія); вимірювання електропровідності розчинів у результаті хімічних реакцій, змін концентрації, температури тощо (кондуктометрія); вимірювання кількості електричного струму, витраченого при кількісному електрохімічному перетворенні речовин (кулонометрія).
Полярографія – це електрохімічний метод, в основі якого лежить автоматична реєстрація сили струму при поступовому збільшенні напруги на електродах, занурених у досліджуваний розчин. Під час проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки, на яких сила струму пропорційна концентрації реагуючих речовин. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.
У полярографічному методі використовують явище концентраційної поляризації, яке виникає на електроді з малою поверхнею при пропусканні електричного струму крізь розчин електролітів. За допомогою полярографії можна виявляти наявність і концентрацію багатьох біомолекул (амінокислот, гормонів, вітамінів, вуглеводів) та їх компонентів.
Принцип методу полярографії можна застосовувати з аналітичною метою при титруванні певних речовин – амперометричне (полярометричне) титрування. В цьому методі також передбачається реєстрація зміни сили струму, в якому існує залежність між зміною концентрації електроактивної речовини та величиною дифузійного струму.
Метод амперометричного титрування порівняно з класичною полярографією має низку переваг. Насамперед це стосується точності – метод дозволяє визначати до 10-6 моль/л речовини, тобто на порядок вище чутливості звичайної полярографії; для проведення аналізу можуть досліджуватися розчини з великим розведенням (до 0,001М), а також забарвлені та каламутні розчини.
Метод амперометричного титрування поєднує перебіг різноманітних і взаємопов’язаних хімічних та електродних процесів, він знаходить застосування в різнобічних дослідженнях кінетики цих процесів, складу утворених речовин, їх розчинності, участі в комплексоутворенні тощо. У біохімічних дослідженнях цей метод найчастіше використовують для титрування SH-груп та S-S зв’язків у білках.
Потенціометрія базується на залежності потенціалу електроду від фізичних і фізико-хімічних процесів, які відбуваються в розчині. Величина потенціалу залежить від складу та концентрації (активності) іонів у розчині, характеру хімічних реакцій, природи електроду та інших чинників. При постійній величині потенціалу одного електроду за значенням електрорушійної сили можна визначити потенціал другого електроду редокс-пари.
Потенціометричний метод аналізу застосовують для знаходження точки еквівалентності при титрометричних визначеннях (потенціометричне титрування) за різкою зміною потенціалу індикаторного електроду поблизу точки еквівалентності (стрибок потенціалу).
Потенціометрію застосовують також для визначення концентрації іонів у розчині (пряма потенціометрія). За допомогою потенціометричного методу визначають концентрацію іонів водню (рН-метрія) та концентрацію іонів Na+, K+, CI- тощо (іонометрія).
Кондуктометрія. Однією з найважливіших фізико-хімічних властивостей водних розчинів є здатність проводити електричний струм, що обумовлено переміщенням катіонів та аніонів у електроліті. Здатність розчину проводити електричний струм характеризує його опір і електропровідність.
Кондуктометричний метод аналізу поділяють на аналітичний і титрометричний. При аналітичному (кількісному) методі визначення будують графік залежності електропровідності розчину від концентрації речовини, що аналізується. За визначенням електропровідності розчину та за допомогою графіка знаходять концентрацію речовини, що аналізується.
Найбільше значення має вимірювання електропровідності в об’ємному аналізі для визначення точки еквівалентності при титруванні суміші кислот і лугів. У біохімічних дослідженнях титрометричний метод аналізу використовують для визначення окремих неорганічних та органічних карбонових кислот, аміно- й оксикислот, мікроелементів, SH-груп тощо.
Важливе практичне значення одержало кондуктометричне титрування для визначення активності деяких ферментів (зокрема, амінотрансфераз, фосфатаз (кислої та лужної), холінестерази, лактатдегідрогенази тощо).
Радіоізотопні методи. Ці методи ґрунтуються на використанні радіоактивних ізотопів (радіоізотопів, радіонуклідів). Основна перевага цих методів перед іншими фізико-хімічними – висока чутливість. Сучасна техніка методу радіоактивних міток дозволяє визначити вміст багатьох речовин у кількості до 10-12 моль/л. Інша важлива перевага цього методу – радіоізотоп можна вводити в живий організм і проводити дослідження інтактного організму.
Використання радіоізотопних методів дозволяє провести дослідження як на рівні клітини, так і на рівні організму. За допомогою радіоізотопів встановлюють шляхи метаболізму різних сполук. Речовина, яка мітиться радіоізотопом, вводиться в організм, а потім у визначені моменти часу беруть проби, екстрагують з них продукти реакції та аналізують їх. Радіоізотопи широко використовують у клінічній медицині (особливо для діагностики), у фармакології, екології тощо.
Імуноферментний аналіз (ІФА). У біохімії широко використовують методи, які поєднують імунні реакції з іншими фізико-хімічними методами – хроматографічні методи в імунології, імунофлюоресцентний аналіз, імуноелектрофорез і радіоімунний аналіз.
Одне з провідних місць в імунологічних дослідженнях належить імуноферментному аналізу. Це метод поєднує в собі високу специфічність імунологічних реакцій з чутливою каталітичною дією ферментів. ІФА використовують для вивчення будови та функції білків, їх біосинтезу й катаболізму, для визначення широкого класу речовин – гормонів, онкомаркерів, серцевих алкалоїдів, антибіотиків, наркотиків та інших фармакологічних речовин, а також вірусів, бактерій і антитіл проти них тощо.
Основою цього методу є реакція „антиген-антитіло”, тобто специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною (рис. 2).
Для кількісного аналізу в основному застосовують два типи виконання ІФА. Першим етапом їх здійснення виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. У подальшому стає можливим проведення реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують із імобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решта суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже імобілізованим антигеном.
Рис.
2. Схема прямого методу твердофазного
ІФА: 1 – антиген, що міститься в зразку;
2 – антитіла, мічені
ферментом (Е); 3 – комплекс
антиген-антитіло-фермент; 4 – субстрат;
5 – комплекс антиген-антитіло-фермент,
який утворив продукти реакції
Зразки сироватки крові, які містять речовину, що визначають, поміщають у лунки планшету для мікротитрування, на стінках яких сорбовані антитіла, здатні специфічно зв’язувати дану речовину, наприклад, гормон. Одночасно в інкубаційну суміш вносять невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат, який конкурує з гормоном за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після того як зв’язування антигенів відбулося, незв’язані молекули відмивають.
Для визначення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і забарвлені продукти ферментатичної реакції визначають фотометрично. Чим більша кількість гормону знаходиться в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісну оцінку здійснюють за допомогою калібрувальної кривої, яку будують за стандартними зразками з відомою концентрацією.
Ферменти-маркери в методі ІФА виконують роль індикаторів імунологічних реакцій. Концентрація речовин, що реагують, пропорційна інтенсивності забарвлення, флюоресценції або хемілюмінесценції, за якими визначають ферментатичну активність.
Ферменти-мітки входять до складу кон’югатів – сполук, в яких ферменти ковалентно зв’язані залежно від мети досліджень з антитілами або антигенами.
Для ІФА використовують широке коло ферментів: пероксидазу, лужну фосфатазу, галактозидазу, глюкозидазу, уреазу, пірофосфатазу тощо.
Методи гетерогенного імуноферментного аналізу. Ці методи застосовують для розділення вільних і зв’язаних з ферментом-міткою антигенів або антитіл, що досліджуються. Серед гетерогенних методів найпоширенішим є метод твердофазного ІФА або метод ELISA (від. англ. Еnzyme Linked Immunosorbent Assay), в основі якого лежить приєднання до утворених на твердій фазі імунних комплексів антигенів або антитіл, ковалентно зв’язаних із ферментами (кон’югатами) (рис.2).
У
Рис. 2. Схематичне відображення
методу ELISA
У методі непрямого ELISA в лунках мікропанелі адсорбують антиген і інкубують у цих лунках розчин, який містить зразок із антитілом.
У методі непрямого твердофазного ІФА для виявлення комплексу антиген-антитіло використовують антивидові або вторинні антитіла, які мітять фермент.
У результаті утворюється комплекс антиген-антитіло-вторинне антитіло-фермент. Залежно від мети досліджень використовують різні антивидові глобулінові реагенти – з широким спектром специфічності або вузькоспецифічні.
Широкого розповсюдження завдяки простоті, викокій специфічності й чутливості набув метод, який називають „сандвіч” або „визначення антигена методом подвійних антитіл”.
У комбінованому методі ІФА на основі зворотнорозчинних полімерів розчинна у воді поліметакрилова кислота служить сорбентом для антитіл. Фермент заключають у ліпосоми (мікроміхурці), на поверхні яких знаходиться імобілізований антиген. У присутності антитіл виникає лізис ліпосом і фермент переходить у розчин, в якому відбувається ферментативна реакція.
Методи гомогенного імуноферментного аналізу. Гомогенний ІФА або метод EMIT (від англ. Enzyme Imynoassay Technique), базується на ефекті модуляції антитілами активності ферменту-мітки (рис. 3).
Н
Рис. 4. Схематичне відображення
техніки EMIT
У цьому методі реєструється не утворений комплекс антиген-антитіло, а замкнені вільні центри специфічного зв’зування.
Найпоширенішим є метод гомогенного ІФА для аналізу антигена на основі використання міченого ферментом антигена зі стеричним виключенням субстрату.
В одному з методів гомогенного ІЕА використовують імунокапілярну міграцію досліджуваного антигена. Імобілізовані на смужці мембрани з нітроцелюлози, антитіла гальмують міграцію антигена.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) застосовується у діагностиці захворювань, що передаються статевим шляхом. Реакція дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до кількостей, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. ПЛР є багатократно повторюваними циклами синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидтрифосфатів, відповідного сольового буферу та олігонуклеотидних затравок - праймерів, які визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.
Для діагностики кожної інфекції підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянках генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, який має для кожної системи праймерів свою довжину.
ПЛР застосовується у клініці для діагностики гонореї, трихомоніазу, цитомегаловірусу, мікоплазмозу, уреаплазмозу, герпесу тощо.