Лабораторна робота № 2.4. Ультраструктурна організація мітохондрій, пластид.
Мета роботи
Вивчення функцій ультраструктурних компонентів клітин
Завдання
Вивчення хлоропластів в клітинах
Т
Рисунок 4. Бактерії-сульфатредуктори,
растрова електронна мікрофотографія
Головними функціональними навантаженнями пластид і мітохондрій є процеси енергетичного характеру, що призводять до синтезу специфічних молекул аденозинтрифосфату (АТФ), що є донорами енергії для будь-яких клітинних процесів.
В мітохондріях, хлоропластах, так само як в бактеріях, АТФ синтезується одним і тим же способом: за допомогою енергії, що віддається електронами при просуванні їх по електроннотранспортной ланцюга білків внутрішній мембрани, відбувається перенос, "перекачування" протонів з внутрішньої сторони мембрани на зовнішню. Внаслідок цього виникає електрохімічний протонний градієнт, енергія якого за допомогою інших білків використовується для синтезу АТФ.
У хлоропластах рослин, крім того, при використанні енергії АТФ, утвореної в результаті фосфорилювання, відбувається найважливіший біологічний процес - зв'язування СО2 і синтез вуглеводів.
Лізосоми як мембранні внутрішньоклітинні частинки були відкриті біохіміками (Де Дюв, 1955). При вивченні легкої подфракціі макросом з гомогенатов печінки щура було знайдено, що ця подфракція (на відміну від основної фракції макросом - мітохондріальної фракції) має групою кислих гідролітичних ферментів (гідролаз), розщеплюють білки, нуклеїнові кислоти, полісахариди і ліпіди. Склалося враження, що ці ферменти містяться в особливого роду цитоплазматичних частинках, лізосомах. Виявилося, що ферменти ізольованих лізосом проявляють свою активність тільки в тому випадку, якщо попередньо викликається пошкодження самих лізосом, або впливом осмотичного шоку або детергентів, або заморожуванням і відтаванням препаратів. На підставі цього було зроблено висновок, що лізосоми оточені липопротеидной мембраною, яка перешкоджає доступу знаходяться зовні субстратів до ферментів, які знаходяться всередині лізосом.
Характерною рисою лізосом є те, що вони містять близько 40 гідролітичних ферментів: протеїнази, Нуклеази, глікозідази, фосфорілази, фосфатази, сульфітази, оптимум дії яких здійснюється при рН 5. У лізосомах кисле значення середовища створюється через наявність в їх мембранах H + помпи, залежною від АТФ. Крім того, в мембрані лізосом вбудовані білки-переносники для транспорту з лізосом в гіалоплазму продуктів гідролізу: мономери розщеплених молекул - амінокислоти, цукру, нуклеотиди, ліпіди. При ознайомленні з роботою лізосом, завжди виникає питання, чому ж ці мембранні освіти не переварюють самі себе? Найімовірніше, що мембранні елементи лізосом захищені від дії кислих гідролаз олігосахаридних ділянками, які або не впізнаються лізосомними ферментами, або просто заважають гідролазами взаємодіяти з ними. Так чи інакше мембранні компоненти лізосом дуже стійкі до гідролаз, що містяться всередині лізосомних бульбашок.
Наявність деяких гідролаз можна виявити гістохімічними методами. Так однією з характерних гідролаз, що виявляються як у світловому так і в електронному мікроскопі, є кисла фосфатаза, за наявності якої можна чітко визначити, є той чи інший мембранний пухирець лізосомах.
Під електронним мікроскопом видно, що фракція лізосом складається з дуже строкатого класу бульбашок розміром 0,2-0,4 мкм (для клітин печінки), обмежених одиночній мембраною (товщина її близько 7 нм), з дуже різнорідним вмістом всередині (мал. 187, 188). У фракції лізосом зустрічаються бульбашки з гомогенним, безструктурним вмістом, зустрічаються бульбашки, заповнені щільним речовиною, що містить у свою чергу вакуолі, скупчення мембран і щільних однорідних частинок; часто можна бачити всередині лізосом не тільки ділянки мембран, а й фрагменти мітохондрій і ЕР. Іншими словами, ця фракція з морфології виявилася вкрай неоднорідною, незважаючи на сталість присутності гідролаз.
Подібні по морфології частинки були описані ще раніше в різних тканинах багатьох тварин. Однак цитологи не могли з'ясувати функціональні значення цих поліморфних частинок. І тільки поєднання біохімічних, цитохімічних та електронно-мікроскопічних методів досліджень дозволило досить детально розібратися в будові, походження та функціонуванні клітинних лізосом
Обладнання, матеріали і методи.
Мікроскопи, предметні скельця, скельця з лункою, скляні палички, петлі, покривні скельця. піпетки градуйовані на 2мл, 5 мл, 10мл, камера Горяєва, пробірки, чашки Петрі, мірні колби на 100 – 200 мл
Гриби. Дріжджі, пліснява, спори; одноклітинні тварини, рослини.
Порядок виконання роботи і рекомендації
Отримати зразки живих клітин та тканин.
Підготувати для мікроскопії нативні (нефарбовані препарати) типів „висяча крапля” та „роздавлена крапля”.
Приготувати мазки та інші препарати для фарбування.
Фіксувати зразки хімічно та термічно
Провести фарбування за методикою.
Отримані препарати мікроскопувати. Фіксувати зображення на всіх доступних ступенях збільшення, починаючи з меншого в порядку зростання.
Порівняти вигляд клітин фіксованих і фарбованих та нативних.
Налаштувати чітке зображення змінюючи положення конденсора.
Контрольні запитання
Субклітинні елементи.
Підготовка проб для мікроскопії в клітинній біології: основні підходи.
Що таке мікротом?
Барвники для мікропрепаратів, контрастування, селективність.