21 Регенерация ферментативных систем, применяемых в биотехнологии.

Ферментативные системы, применяемые в биотехнологии, имеют относительно высокую стоимость. Поэтому с экономической точки зрения было бы крайне выгодно использовать их многократно. Наиболее дорогостоящим и уязвимым компонентом любой ферментативной системы является непосредственно сам фермент. В ряде случаев в биотехнологических циклах используются ферменты, требующие для проявления своей активности кофакторы. В связи с этим проблема регенерации кофакторов также имеет немаловажное значение. Практически сразу же после обнаружения феномена инактивации ферментов в начале XX в. стали предприниматься попытки их реактивации. К настоящему времени разработано множество достаточно эффективных подходов реактивации ферментов.

Реактивация инактивированных ферментов

Реактивация ферментов с измененной первичной структурой. Для реактивации ферментов, утративших свою активность в результате химической модификации функциональных групп, можно использовать обратную химическую реакцию. Например, ферменты, инактивация которых была вызвана окислением SH-групп, в ряде случаев удается реактивировать с помощью восстанавливающих агентов, в частности низкомолекулярных тиолов. Аналогичную стратегию можно использовать также для реактивации ферментов, потерявших каталитическую активность в результате разрушения внутримолекулярных S–S связей и образования смешанных дисульфидов. Добавление в среду тиолов приведет к расщеплению смешанного дисульфида и последующему образованию правильной S–S связи. Реактивация агрегированных белков. Для реактивации агрегированных белков необходимо разрушить межмолекулярные ковалентные и нековалентные контакты. Для этих целей можно использовать концентрированные растворы мочевины и гуанидинхлорида, а также экстремальные значения рН. В том случае, если при агрегации ферментов образовались межмолекулярные дисульфидные мостики, в среду вносят в относительно невысоких концентрациях (мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например, цистеин или дитиотрейтол). При таких концентрациях внутримолекулярные S–S связи в белке, как правило, не затрагиваются. Десорбция фермента со стенок реакционного сосуда. Десорбция достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий между белком и сорбционными центрами на поверхности сосуда. Для этого можно использовать экстремальные значения рН, а также концентрированные растворы мочевины или гуанидинхлорида. Реактивация необратимо денатурированных ферментов. На первом этапе добиваются полного разворачивания инактивированного фермента путем разрушения всех нековалентных взаимодействий в белковой молекуле. Для этого можно использовать концентрированные растворы мочевины или гуанидинхлорида. Если в белке присутствуют S–S связи, то действие обратимых денатурантов (мочевины и гуанидинхлорида) усиливают добавлением в среду тиолов. На следующем этапе создают условия, при которых развернутый белок может свернуться в каталитически активную конформацию. В ряде случаев правильная укладка белка обеспечивается добавлением в среду так называемых эффекторов ферментативной активности – субстратов, ингибиторов и кофакторов. Данный подход был успешно использован для реактивации многих необратимо денатурированных ферментов. Реактивация ферментов, инактивированных в результате десорбции кофактора из активного центра или диссоциации олигомерных белков на субъединицы. Как уже ранее отмечалось, десорбция кофактора из активного центра или диссоциация олигомерных белков на субъединицы в конечном итоге приводит к агрегации и/или химической модификации важных функциональных групп фермента. Поэтому для реактивации подобным образом инактивированных ферментов можно использовать подходы, рассмотренные выше.

Регенерация кофакторов (коферментов) для регенерации используется система сопряженных реакций. В зависимости от типа сопряженной реакции можно выделить два способа регенерации: ферментативный и неферментативный. К ферментативным относятся методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов. Неферментативные способы регенерации включают в себя химические и электрохимические подходы. Ферментативный способ 1. Использование сопряженных субстратов. В систему вводят избыточное количество сопряженного субстрата того же фермента.

Образовавшийся в ходе реакции НАД+ можно регенерировать, добавив в систему в качестве сопряженного субстрата этанол. В присутствии этанола число циклов регенерации может достигать 800. Наряду с несомненными преимуществами данный подход имеет два существенных недостатка: • необходимость использования высоких концентраций сопряженного субстрата, так как равновесие реакции сильно сдвинуто в сторону образования спирта; • введение в систему дополнительных реагентов усложняет процедуру выделения основного продукта из реакционной смеси. 2. Использование сопряженных ферментативных реакций. В систему, содержащую фермент 1, который катализирует реакцию получения основного продукта, дополнительно вводят фермент 2, функционирование которого обеспечивает регенерацию кофермента.

Используемые в системе ферменты должны иметь разную субстратную специфичность, для того чтобы исключить возможность конкуренции основного и вспомогательного субстратов.

Неферментативные способы Неферментативные методы (химические и электрохимические) обладают низкой специфичностью и поэтому менее распространены по сравнению с ферментативными. Химические методы. В качестве реагентов для химической регенерации используются дитионит натрия и некоторые соли пиридиния. Низкая стоимость этих веществ делает химическую регенерацию привлекательной с экономической точки зрения. Однако дитионит и пиридиниевые соли могут ингибировать отдельные ферменты. В последнее время для химической регенерации применяют флавинмоно- нуклеотид. Флавиновые коферменты участвуют в процессах регенерации НАД+ in vivo и отличаются сравнительной дешевизной. В ряде случаев флавинмононуклеотид иммобилизуют, например, на полиэтиленимине. Электрохимические методы. Для регенерации коферментов можно использовать их прямое электрохимическое восстановление или окисление. К недостаткам данного подхода следует отнести возможность появления в процессе регенерации ферментативно неактивных форм кофермента, например в результате его димеризации. Этого можно избежать, если для электрохимической регенерации использовать иммобилизованный кофермент.