Дата_____________

ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 18

Тема: Реакція імунного лізису (бактеріоліз, гемоліз). Реакція зв'язування комплементу (РЗК).

	Завдання для самостійної роботи:
а) Перелік питань, що підлягають вивченню:
1.	Клітинна імунна відповідь. Види імунних реакцій клі-	татів реакції, практичне застосування.
тинного типу.		б) Перелік практичних навичок та вмінь, якими необхідно оволо-
2.	Гуморальна імунна відповідь і її етапи.
3.	Реакція імунного лізису: компоненти, механізм, прак-	діти:
тичне застосування.
4.	Реакція бактеріолізу: компоненти, методика постанов-	1. Проводити облік та оцінювати результати реакції зв'язу-
ки, оцінка результатів, практичне застосування.		вання комплементу.
5.	Реакція імунного гемолізу: компоненти, методика пос-	Література:
тановки, облік і оцінка результатів. Застосування.
6.	Реакція зв'язування комплементу (РЗК): компоненти,	1) с. 160-167; 179-180; 2) с. 234-235; 3) с. 140-145; 4) с. 47-54; 5) с.
механізм, методика постановки, облік і оцінка резуль		118-122; 107; 6) с. 105-106; 134-135; 7) с. 200-215; 221-222; 8) с.
		185-192; 200-201.

67

Протокол практичного заняття:

Практичні завдання, що підлягають виконанню:

Завдання № 1: Провести облік та оцінити результати реакції зв'язування комплементу (РЗК) з сироваткою хворого і гонококовим діагностикумом.

	Інгредієнти
	(мл) Досліджувана
		сироватка	Антиген	Комплемент	Фізіологічний
		(розведення	(робоча доза)	(робоча доза)	розчин
Номер пробірок		1:10)
1	(дослід)	0,5	0,5	0,5	-
2	(контроль сироватки)	0,5	-	0,5	0,5
3	(контроль антигену)	-	0,5	0,5	0,5

«+» - позитивний результат «-» - негативний результат

Висновок:

		Гемолітична система
	година1–			година1–
		Гемолітична	Еритроцити
		сироватка	барана
	37ºС	0,5	0,5	37ºС
		0,5	0,5
		0,5	0,5

Облік

Гемоліз РЗК

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

Підпис викладача______________________

64

Дата_____________

ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 19

Тема: Реакції з використанням мічених антигенів та антитіл.

Завдання для самостійної роботи:

а) Перелік питань, що підлягають вивченню:		б) Перелік практичних навичок та вмінь, якими необхідно оволо-
1.	Реакція імунофлюоресценції (РІФ): пряма і непряма.
2.	Імуноферментний аналіз (ІФА): прямий, непрямий, твер-	діти:
дофазний, конкурентний, імуноблотінг.		1. Проводити облік та оцінювати результати реакції імуно-
3.	Радіомунний аналіз (РІА): конкурентний, зворотний, не-	флюоресценції, імуноферментного аналізу.
прямий.		Література:
4.	Імуноелектронна мікроскопія.
5.	Практичне використання зазначених методів дослі-	1) с. 182 - 183; 2) с. 233 - 234; 236-238; 3) с. 145-151; 4) с. 54 - 63; 5)
дження.		с. 114 -115; 118; 6) с. 117 - 119, 126 -128; 7) с. 223-225; 8) с. 204.

65

Протокол практичного заняття:

Практичні завдання, що підлягають виконанню:

Завдання № 1: Замалювати схему прямої і непрямої реакції імунофлюоресценції (РІФ).

пряма РІФ

непряма РІФ

64

Завдання № 2: Замалювати схему прямого і непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА).

прямий ІФА

непрямий ІФА

65

Завдання № 3: Провести облік та оцінити результати імуноферментного аналізу (ІФА) з метою виявлення антитіл до антигенів збудника сифілісу. Внести результати досліджень до таблиці.

Дані фотометрії досліджуваних зразків

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

В

С

D E F G H

Висновок:

______________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________

Підпис викладача_______________________

66

Дата_____________

ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 20

Тема: Імунний статус людини та методи його оцінки. Природні та набуті імунодефіцитні стани.

Завдання для самостійної роботи:		глобулінів (ІgА, ІgМ, ІgG), загальної
а) Перелік питань, що підлягають вивченню:		кількості лімфоцитів, Т- і В-лімфоцитів;
1. Поняття про імунний статус. Імунний статус, як динамі-		б) імунологічні тести II рівня (аналітичні): НСТ-тест,
чна врівноважена система.	визначення ЛКБ, кількості Т- і В-лімфоцитів та
2. Імунодефіцитні стани та причини їх виникнення.		їх субпопуляцій (СD4+, СD8+ та інші), специфічних
3. Первинні та вторинні імунодефіцитні стани. Особливос-	ІgЕ, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК),
ті імунної відповіді (реактивності) при порушенні най-		функціональної активності лімфоцитів (реакція бла-
більш уразливих ланок імунної системи.	сттрансформації лімфоцитів (РБТЛ).
4. Показники, що характеризують стан імунної системи	6. Загальні правила, яких доцільно дотримуватись при ін-
організму людини (імунограма):	терпретації імунограм.
а) неспецифічні показники (макрофаги, нормальні кі-	7. Практична значимість оцінки імунограм.
лери, комплемент, інтерферони, лізоцим);	б) Перелік практичних навичок та вмінь, якими необхідно оволо-
б) специфічні показники (імуноглобуліни, Т- і В-	діти:
лімфоцити та їх субпопуляції, індекс стимуляції	1.	Навчитись заповнювати бланки імунограм.
мітогенами та інші).	2.	Вміти оцінювати імунограму.

5.Методи оцінки загального стану імунної системи та мо-

тиви їх вибору:	Література: 1) с. 158-160; 183 -187; 2) с. 215-224; 148; 225 - 228;
а) імунологічні тести І рівня (орієнтовні): визначення	3) с. 151-160; 4) с.102-107; 123 -125; 5) с. 108 - 112; 6) с.208-209;
титру комплементу, оцінка фагоцитарної активності нейт-	216-218; 494-497; 221, 225 - 230; 7) с. 181 – 185; 212 - 216; 8) с. 139
рофілів, концентрації основних класів імуно	- 141, 170 – 175.

67

Протокол практичного заняття:

Завдання № 1:	Практичні завдання, що підлягають виконанню:
	Мікроскопіювати демонстраційні препарати для визначення НСТ-тесту, замалювати нейтрофіли різних груп (в залеж-
ності від кількості гранул диформазану в цитоплазмі).
0	1	2	3

Завдання № 2: Оцінити кисень-активуючу здатність нейтрофілів за НСТ-тестом у обстежуваних людей, використовуючи результати підрахунку нейтрофілів в мазку крові та розподілу їх по групам ( див. додаток стор. 76-77):

Обстежувані

№1

№2

О - нейтрофіли без гранул

1- нейтрофіли з одиничними гранулами або з площею забарвленої цитоплазми до 25-30%

2 – нейтрофіли, цитоплазма яких на 30-70% заповнена гранулами диформазану

68

3 - нейтрофіли, цитоплазма яких на 100% заповнена гранулами диформазану

Розрахувати середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), занести до бланків імунограм.

Обстежуваний № 1 СЦК =

Обстежуваний № 2 СЦК =

Висновок:

_________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

Завдання № 3: Визначити концентрацію імуноглобулінів класів А, М, і G у сироватках крові обстежуваних імуноферментним методом за результатами фотометрії контрольних та досліджуваних зразків, використовуючи обернено-пропорційний розрахунок та враховуючи концентрацію імуноглобулінів у контрольних пробах ( див. додаток стор. 74-75):

ІgА -1,59 мг/мл; ІgМ -1,32 мг/мл; ІgG - 8,95 мг/мл. Результати фотометрії занести до таблиці.

Визначені концентрації Іg (А, М, G) занести до бланків імунограм.

69

	1	2			3	4	5	6		7	8	9	10		11	12
А	б	3		7		11	б	3		7	11	б	3		7	11
		0,103						0,104					0,041
В	б	3		7		11	б	3		7	п	б	3		7	11
		0,104						0,106					0,039
С	кс	4		8		12	кс	4		8	12	кс	4		8	12
	0,152						0,119					0,108
D	кс	4		8		12	кс	4		8	12	кс	4		8	12
	0,150						0,120					0,110
E	1	5		9		13	1	5		9	13	1	5		9	13
	0,138						0,036					0,043
F	1	5		9		13	1	5		9	13	1	5		9	13
	0,140						0,037					0,045
G	2	б		10		14	2	б		10	14	2	6		10	14
	0,112						0,130					0,092
Н	2	б		10		14	2	6		10	14	2	6		10	14
	0,114						0,132					0,094
			Іg	А					Іg	М				ІgG

70

Обстежуваний №1

Обстежуваний №2

IgA

IgM

IgG

Висновок:_______________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

Завдання № 4: Занести	до бланків імунограм результати		обстеження пацієнтів, оцінити одержані результати.
			Iмунограма
Показники	Вміст в 1 мкл (%)			Обстежуваний № 1	Обстежуваний № 2
Абсолютне число лейко-	4500-7000 (100 %)
цитів
У тому числі: нейтрофілів	4000 (65%)
Еозинофілів	200-400 (4%)
Абсолютне число лімфоцитів	1500-2000 (25%)
-CD3 (Т-загальні)	800-1200
-CD4 (Т-хелпери)	500-900
-CD8 (Т-кілери)	400-600
-CD16 (NK)	170-400
-CD20 (В-клітини)	200-400
HLA ІІ	340-720
			71

Імуноглобуліни
IgG		8-12 г/л
IgM		0.5-1,9 г/л
IgA		1,4-4,2 г/л
IgE		20-100 КЕ/л
ЦІК, (умов.од.)		20-80
Фагоцитоз
		Спонтанний	Стимульований	Індекс стиму-
				ляції
НСТ-тест (од.млн.кл.)		70-120	150-200	1,2-2
Фагоцитоз (%)		48-88
Індекс фагоцитозу		1,3-3
Адгезія (%)		40-55	70-80
Реакція бласттрансформації
		ФГА	PWM
РБТЛ		20-100	5-20

Комплемент

C1q	100-250
C3	700-1800
C4	200-500
C5a	0,01-0,03

Висновок:________________________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________________________________________

Підпис викладача_______________________

72

1. Визначення числа лейкоцитів в крові.

Метод ґрунтується на підрахунку лейкоцитів в одиниці об'єму (л або мкл) крові при постійному розведенні крові і визначеному об'ємі камери для підрахунку. Підрахунок лейкоцитів ведуть при малому збільшенні мікроскопа (об'єктив х8, окуляр х10), затемненому полі зору (опущений конденсор або звужена діафрагма) в 100 великих квадратах камери Горяєва, одержане число множать на 50, виражають у вигляді а·

109/л або тис/мкл.

2. Визначення числа лімфоцитів в крові.

Визначення числа лімфоцитів в крові проводять шляхом підрахунку лейкоцитарної формули, визначають відсоткове співвідношення лейкоцитів в мазку крові, забарвленому за Романовським-Гімза або Папенгеймом. Знаючи відсотковий вміст лімфоцитів і загальне число лейкоцитів в одиниці об'єму крові, знаходять абсолютну кількість лімфоцитів в крові (в 1 л або мкл).

3. Визначення субпопуляційного складу лімфоцитів крові методом непрямої імунофлюоресценції.

Принцип методу: специфічні моноклональні антитіла зв'язуються з мембранними антигенами (рецепторами СD3 , СD4 , СD8, СD16, СD2 0 та ін.) живих клітин (лімфоцитів), які знаходяться у суспензії. Для виявлення даного комплексу використовують антивидові антитіла до імуноглобулінів, мічені флюорохромом. При люмінесцентній мікроскопії препаратів визначають відсотковий вміст лімфоцитів певної субпопуляції, а потім вираховують їх абсолютну кількість та співвідношення окремих субпопуляцій (СD4/СD8, СD3/СD20).

4. Визначення концентрації Іg А, М, G.

Для кількісного визначення імуноглобулінів в сироватці крові та інших біологічних рідинах людини використовують твердофазний метод імуноферментного аналізу (ІФА).

Прямий твердофазний метод ІФА заснований на принципі „сендвіча". Аналіз проводиться в дві стадії.

На першій стадії контрольні зразки з відомою концентрацією імуноглобулінів (А, М, G) і досліджувані проби інкубуються в лунках полістіролового планшета з іммобілізованими моноклональними антитілами (МКАТ) до імуноглобулінів (A, M, G). Потім планшет “відмивається” (для видалення із системи інших, неспецифічно зв`язаних з моноклональними антитілами компонентів).

На другій стадії імуноглобулін (А, М, G), що зв'язався в лунках, обробляють кон'югатом МКАТ до Іg (А, М, G) людини з пероксидазою (МКАТ у складі кон'югату та іммобілізовані в лунках планшета МКАТ специфічні до різних ділянок молекули Іg (А, М, G).

Після „відмивання" надлишку кон'югата імунні комплекси „іммобілізовані МКАТ -1g (А, М, G) - кон'югат" виявляють ферментативною реакцією пероксидази з перекисом водню в присутності хромогену. Інтенсивність забарвлення хромогену пропорційна концентрації Іg (А, М, G) в досліджуваному зразку. Після зупинки пероксидазної реакції стоп-реагентом результати реєструють фотометрією зразків (вимірюють оптичну густину в лунках планшета при 492 нм).

73

1 - МКАТ до Іg (А,М,G), іммобілізовані в лунках планшета;

2 - Іg (А,М,G) досліджуваних зразків;

3 - кон’югат (МКАТ до Іg (А,М,G) з ферментною міткою.

Конкурентний твердофазний метод ІФА.

В лунки полістиролового планшета з іммобілізованими імуноглобулінами людини ( ІgA – 1-4 ряди, IgM – 5-8 ряди, ІgG – 9 –12 ряди) вносять контрольні сироватки (“кс”) з відомою концентрацією Іg ( А, М, G ), досліджувані зразки (14) та фосфатно-сольовий буфер (“б”, використовується для розведення зразків, контролів, кон`югатів, промивання планшета). Безпосередньо після цього в лунки вносять відповідні розчини кон`югатів ( кон`югат А ).

( МКАТ до ІgА з ферментною міткою – пероксидазою) – в 1-4 ряди, кон`югат М – в 5-8 ряди, кон`югат G в 9-12 ряди ). Імуноглобуліни, що містяться в досліджуваних зразках, конкурують з іммобілізованими на твердій фазі імуглобулінами за зв`язок з кон`югатом. Ступінь зв`язування введених МКАТ з імуноглобулінами твердої фази знижується (їх “перехвачують” імуноглобуліни досліджуваних зразків). Після інкубації планшет промивають. Зв`язок МКАТ у складі кон`югату з іммобілізованими імуноглобулінами оцінюють за допомогою ферментативної реакції пероксидази з перекисом водню в присутності хромогену. Для цього в лунки вносять субстратну суміш (субстрат – Н2О2 та хромоген) і знову інкубують. Після зупинки стоп-реагентом ферментативної реакції результати реєструють фотометрією зразків.

1 - іммобілізовані в лунках планшета імуноглобуліни (А,М,G); 2 - МКАТ до Ig (А,М,G) з ферментною міткою;

3 - імуноглобуліни (А,М,G) досліджуваних зразків.

Концентрацію імуноглобулінів (А, М, G) в досліджуваних зразках визначають по калібровочному графіку, або використовують обернено пропорційний розрахунок:

Рк - оптична густина контрольного зразка,

Рх - оптична густина досліджуваного зразка,

Ск - концентрація імуноглобуліну в контрольному зразку,

Сх - концентрація імуноглобуліну в досліджуваному зразку.

Виходячи з цього:

5. Визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК).

Воснові методу лежить здатність розчину поліетиленгліколю (ПЕГ) осаджувати із сироватки агреговані імуноглобуліни та імунні комплекси. Низькі концентрації ПЕГ осаджують комплекси великих розмірів, високі концентрації викликають преципітацію низькомолекулярних сполук. Зміна густини розчинів реєструється на спектрофотометрі при довжині хвилі 280 нм.

6. Визначення фагоцитарної активності нейтрофілів.

Воснові методу лежить здатність фагоцитів (нейтрофілів) захоплювати частинки латексу, які забарвлюються за Романовським-Гімза в бла-

китний колір. Під мікроскопом продивляються 100 лейкоцитів (нейтрофілів) і визначають кількість захоплених ними часточок, поглинутих в середньому одним нейтрофілом і відсоток фагоцитуючих нейтрофілів - тобто, кількість нейтрофілів із 100, які проявили фагоцитарну активність (а).

Кількість фагоцитуючих	Кількість				Кількість захоплених нейтрофілом часточок
нейтрофілів	“пустих”
			1-10			11-20			21 і більше
	нейтрофілів
а	б		В				г		д
Фагоцитарне число (кількість часточок	в одній клітині) =		5 · в +а15 · г + 25 · д
де 5, 15, 25 - кількість часточок в одному нейтрофілі; в, г, д - кількість
				нейтрофілів.

7. Визначення кисень-активуючої здатності нейтрофілів за НСТ-тестом.

Метод заснований на здатності зрілих гранулоцитів відновлювати за рахунок активних форм кисню (супер-оксиданіонрадикал, що виділяється при активації дихального вибуху нейтрофілів) піноцитований світло-жовтого кольору барвник тетразолієвого ряду - нітросиній тетразолій (НСТ) до нерозчинної форми - диформазану, який має вигляд темно-синіх гранул в цитоплазмі нейтрофілів.

Застосовують спонтанний та стимульований (убитою культурою золотистого стафілококу або зимозаном) НСТ-тест. В мазку крові при імерсійній мікроскопії підраховують 100 нейтрофілів, розподіляючи їх по групам в залежності від кількості гранул диформазану в цитоплазмі.

0- нейтрофіли без гранул;

1- нейтрофіли з одиничними гранулами або з площею забарвленої цитоплазми до 25-30%;

75

2 - нейтрофіли з цитоплазмою, на 30-70% заповненою гранулами диформазану; 3 - нейтрофіли, цитоплазма яких на 100% заповнена гранулами диформазану. Розраховують середній

цитохімічний коефіцієнт за формулою:

де а, б, в, г, д- кількість нейтрофілів однієї групи; 0, 1, 2, 3 - групи нейтрофілів.

Якщо застосовують спонтанний і стимульований НСТ-тест, то розраховують індекс стимуляції:

8. Визначення лізосомальних катіонних білків (ЛКБ).

Катіонні білки - це неферментні білки, медіатори запалення, які локалізуються в лізосомах гранулоцитів і відіграють важливу роль в реалізації бактерицидної функції нейтрофілів. ЛКТ - це метод, що дозволяє швидко визначити зсув у рівні неспецифічної резистентності та дати оцінкутяжкості перебігу захворювання.

В основі цитохімічного дослідження катіонних білків - використання діахромних аніонних барвників.

Лізосоми нейтрофільних, еозинофільних гранулоцитів та бактерії, що загинули під впливом катіонних білків, забарвлюються в один колір (в залежності від барвника, що застосовується: забуферений спиртовий розчин тривкого зеленого - в зелений, бромфеноловий синій - в синій), а клітинні елементи (ядра) і життєздатні бактерії - в інший (при застосуванні азура А - в бузковий та синій кольори, сафраніну - жовтогарячий та червоний). При імерсійній мікроскопії

препарату (мазка крові, кісткового мозку, мокротиння, препарату-відбитка з поверхні вогнища запалення, змивів з бронхів) підраховують 100 нейтрофілів, розподіляючи їх по групам в залежності від наявності позитивної реакції на КБ та їх інтенсивності:

0 - не дають позитивної реакції на катіонні білки;

1- дають слабко виражену позитивну реакцію;

2- дають виражену позитивнуреакцію;

3- дають яскраво виражену позитивну реакцію.

Розраховують середній цитохімічний коефіцієнт за формулою:

76