7. Мутации у бактерий. Характеристика типов мутаций. Спонтанные и индуцированные мутации, механизмы возникновения, значение мутаций

Мутации - стабильное изменение первичной структуры геномной ДНК , которое приводит к наследственно закрепленному изменению или утрате одного или нескольких признаков, не связанное с генетическим обменом или присутствием плазмид.

Типы мутаций:

Спонтанные мутации возникают в обычных условиях под влиянием природных факторов,ошибок в репликации генома, действия транспозонов и Is-элементов.

Индуцированные мутации получают с помощью обработки бактериальной культуры мутагенами - факторами химической, физической или биологической природы, способными вызывать повреждения ДНК .

В зависимости от степени мутационных повреждений мутации подразделяют на :

Хромосомные - крупные перестройки в отдельных фрагментах ДНК. (Делеции - выпадение нескольких нуклеотидов , инверсии - поворот участка хромосомы на 180*, дупликации - повторение участка хромосомы, дислокации - изменение последовательности нескольких оснований). Бывают летальными, обычно приводящими мутировавшие бактерии к гибели.

Генные (точковые) мутации - изменение одной пары оснований. Различают : выпадение или вставки оснований, простые замены (транзиции) - при которых пурин заменяется на другой пурин( аденин>гуанин) , пиримидин на другой пиримидин ( тимин>цитозин), сложные замены (трансверии) , когда пурины заменяются на пиримидины(а>т , ц>г). Точковые мутации возникают с большой частотой и имеют большое значение в Генотипической изменчивости бактерий, способствуя их эволюции.

Прямые мутации - связаны с потерей функцией.Обратные мутации - с восстановлением этой функции

№8 Генетические рекомбинации у бактерий. Способы переноса генетической информации из клетки в клетку. Трансформация: сущность, условия возникновения, этапы, значение.

Рекомбинации- это процесс взаимодействия между двумя молекулами ДНК, приводящий к образованию новой рекомбинантной молекулы.

Типы генетических рекомбинаций у бактерий: трансформация, трансдукция, конъюгация.

Трансформация- тип генетического обмена, при котором участок нативной молекулы ДНК донора проникает в бактерию-реципиент и вызывает изменение ее генотипа. Для того, чтобы трансформация была успешной, ДНК донора и бактерии-реципиента должны обладать определёнными свойствами:

- ДНК донора должна быть выделена из бактериальной культуры того же вида, что и реципиент (или близкородственного). Участок трансформирующей ДНК должен сохранять интактную структуру (двунитчатую спирализацию) и иметь значительную молекулярную массу.

- Клетки реципиентной бактериальной культуры для осуществления трансформации должны быть компетентными, то есть способными адсорбировать на своей поверхности ДНК донора и поглащать ее

Стадии трансформации:

1. Адсорбция фрагментов двунитивой ДНК донора на поверхности клеточной стенки компетентных клеток. ДНК связывается с участками поверхности, доступными только у компетентных клеток.

2. Ферментативное расщепление адсорбированной молекулы двунитивой ДНК на более мелкие фрагменты с помощью индуцированной клеточной эндонуклеазы.

3. Проникновение фрагментов ДНК сопровождается разрушением одной из нитей ДНК и освобождением энергии, необходимой для дальнейшего проникновения.

4. Проникший однонитевый фрагмент ДНК взаимодействует с участком высокой гомологии генома клетки реципиента с образованием гибридной молекулы ДНК (гомологичная рекомбинация), в которой одна нить содержит генотип реципиента, а вторая нить является рекомбинантной.

Трансформация является одним из факторов эволюции бактерий. Появляющиеся рекомбинанты с новым сочетанием генов играют определённую роль в естественном отборе. С помощью трансформации проводится тонкое картирование генов, уточняются генетические карты.

№9 Генетический обмен у бактерий. Конъюгация: сущность, этапы, значение. Типы штаммов-доноров: F+; Hfr; F`: свойства донорных клеток и особенности взаимодействия с реципиентом.

Конъюгация- форма обмена генетическим материалом между бактериями при их непосредственном клеточном контакте. Этот процесс контролируется F-плазмидами, а также другими конъюгативными плазмидами. При конъюгации донорами являются “мужские” клетки, содержащие F-плазмиды, а реципиентами являются “женские” F-минус клетки, у которых плазмида отсутствует.

Бактериальные штаммы, в клетках которых F-фактор интегрирован в хромосомы носят название Hfr-штаммы.

F`-свободная плазмида,несущая несколько бактериальных генов.

Типы скрещиваний: F+ x F-; Hfr x F-;F` x F-

Клетки-доноры возможно отличить от реципиентных клеток по наличию F-пилей, дополнительного поверхностного антигена, по чувствительности к некоторым РНК-бактериофагам, а также по ряду физико-химических свойств.

№10 Генетические рекомбинации у бактерий. Типы рекомбинации по молекулярному механизму. Способы переноса генетического материала из клетки в клетку. Трансдукция: сущность, типы трансдукции, значение.

Генетические рекомбинации по молекулярному механизму делятся на гомологичную, сайт-специфическую и незаконную рекомбинацию.

Трансдукция- процесс переноса генетического материала от бактерии-донора к бактерии-рецепиенту с помощью бактериофага. Трансдукция осуществляется дефектными бактериофагами, которые не способны к самостоятельной репродукции в клетке и для формирования фагового потомства нуждаются в присутствии родственного фага.

Типы трансдукции: неспецифическая (общая) и специфическая (локализованная) и абортивная.

Спомощью трансдукции происходит перенос бактериальных генов, плазмид и транспозонов, что используется в генной инженерии.

№11 Микробиологические основы генной инженерии и биотехнологии- клонирующий вектор, эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазы, клонирование ДНК. Применение генной инженерии в микробиологической биотехнологии: создание диагностических, лечебных и профилактических препаратов.

Генная инженерия- раздел молекулярной генетики, представляющий собой совокупность методов и технологий для создания in vitro рекомбинантных молекул ДНК или РНК и способов их переноса. В результате клетки, получившие чужеродные гены, приобретают способность синтезировать белки, которые они ранее не синтезировали.

Рекомбинантные молекулы содержат два компонента- вектор(переносчик) и клонируемую “чужеродную” ДНК.

Векторами являются циркулярно замкнутные молекулы ДНК- плазмиды, умеренные бактериофаги или вирусы животных, иногда космиды( плазмиды с липкими концами, cos-сайтами ДНК бактериофага лямбда). Они должны обладать рядом свойств, в частности:

- самостоятельно реплицироваться

- нести в своем составе участки рестрикции

- содержать маркеры фенотипа

Клонируемые молекулы ДНК- это фрагменты ДНК, имеющие определённые гены, кодирующие синтез нужного вещества. Их получают экстракцией натриевой ДНК, с помощью фермента обратной транскриптазы на молекуле и-РНК и синтезов генов химическим способом.

Рекомбинантную молекулу ДНК можно получить с помощью фермента рестриктазы. Обрабатываются ДНК вектора и изолированные ДНК эндонуклеазой рестрикции,которая расщепляет взятые молекулы ДНК в строго определенном месте с образованием однонитчатых, комплементарных друг друг концов. Далее фермент полинуклеотидлигаза сшивает две разные линейные молекулы ДНК в одну рекомбинантную ДНК.

Генная инженерия применяется для переноса генной информации из одной клетки в другую,преодолевая даже межвидовые барьеры; для создания микроорганизмов-продуцентов ферментов, гормонов, вакцин, антигенных препаратов и т.д.

№12 Молекулярно-генетические методы диагностики. Амплификационные технологии: конвенциональная ПЦР, ПЦР в реальном времени. Некоторые разновидности ПЦР: ПЦР с обратной транскрипцией, мультиплексная ПЦР и др. Области применения генетических технологий.

Молекулярно-генетические методы- методы, позволяющие в генетических материалах обнаруживать фрагменты геномов.

ПЦР- метод получения большого количества специфических нуклеотидных последовательностей ДНК in vitro. Амплификация-умножение определенных генов или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и индентифицирован.

Этапы:

1. Денатурация- разъединение определяемой двухцепочечной ДНК на две изолированные цепочки при нагревании до 90-95 градусов по Цельсию в течении 0.5-1 минут.

2. Отжиг- восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера при температуре 40-60 0.5 минут.

3. Удлинение (элонгация)- достройка каждой цепи определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК- полимеразы- проводится при температуре 70-75 в течение 2-5 минут.

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

№13 Молекулярно-генетические методы диагностики. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК. Области применения генетических технологий.

Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотиднойпоследовательности (от лат. sequentum — последовательность). В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов^[1][2].

Для секвенирования применяют методы Эдмана, Сэнгера и другие; в настоящее время для секвенирования генов обычно применяют метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР.

Микрофлора тела человека