6.Методы культивирования облигатных анаэробов. Способы создания бескислородных условий, применяемая аппаратура. Этапы выделения чистых культур облигатных анаэробов.
Механические методы:
1. Посев уколом в столбик сахарного агара.
2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.
3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.
Физические методы:
1. Анаэростат — создание вакуумных условий.
2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).
3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,
Химические методы
1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.
2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.
Биологический метод Фортнера
Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.
Аппаратура: микроанаэростаты - толстостенные металлические или пластиковые цилиндры с герметичечки закрывающимися крышками, на которых имеются вакуометр и краны для присоединения к вакуум насосу или баллону с газом. Засеянные анаэробами питательные среды помещают в анаэростат,откачивают воздух и замеряют его газовой смесью, инкубируют 2-3 суток при t =37º
Вместо анаэростатов используют газонепроницаемые полиэтиленовые пакеты
Анаэробный бокс - прозрачная плексиглазовая камера о шлюзом, отверстиями для рук с рукавами, заканчивающимися резиновыми перчатками. В ем создают стерильные условия, закачивают газовую смесь поддерживают температуру 37 ºС.
Этапы выделения чистых культур облигатных анаэробов.
1) получение изолированных колоний (посевы на пит средах инкубируют в микроанаэростатах 48-72ч при 37º.
2) получение чистой культуры ( изучают морфологические и культуральные свойства. проводят параллельный рассев каждой отобранной колонии на 2 чашки Петри с пит средой, 1 чашку инкубируют в аэробных условиях, другую в - в анаэробных)
Отбирают культуры, которые выросли в анаэробных условиях ( исключение факультативных анаэробов)
3) идентификация выделенных облигатных анаэробов (биохимическая, микротест -система)
7.Ферменты бактерий: классификация, свойства. Постоянные и непостоянные ферменты, генетическая регуляция. Экзо- и эндоферменты. Специфичность действия ферментов. Ферменты патогенности. Методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Их диагностическое значение.
Ферменты-это спец-ие орг-ие катализаторы белковой природы.фер-ты м.б.простыми и слож.Прос - уреаза, пепсин, трипсин, амилаза. Слож. - каталаза,дегидрогеназа, цитохромы.
В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут локализоваться как внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепляют крупные молекулы пептидов, полисахаридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых случаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзоферментов можно определить при помощи дифференциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.
По постоянству действия:
- Ферменты, постоянно участвующие в обменных процессах - конституитивные. Они принимают активное участие в синтезе структурных компонентов.
- Ферменты, действующие только при наличии субстрата – адаптационные: ферменты транспорта и катаболизма лактозы – галактоздпермиаза, β-галактозидаза, галактозидацетилтрансфераза.
Ферменты патогенности:
1) гиалуронидаза – расщепляет ГАГ (матрикс соедин. ткани), что облегчает механическое продвижение по ткани
2) уреаза – расщепляет мочевину с образованием аммиака, что помогает выжить в очень кислой среде
3) гемагглютинины – запускают агглютинацию крови, что создает благоприятные условия для роста и размножения моргов.
4) лецитиназа – расщепляет желток куриного яйца
5) пенициллаза – расщепляет пенициллин (первый антибиотик)
Различают два главных вида специфичности ферментов: субстратную специфичность и специфичность действия.
Субстратная специфичность, это способность фермента катализировать превращения только одного определенного субстрата или же группы сходных по строению субстратов. Определяется структурой адсорбционного участка активного центра фермента.
Различают 3 типа субстратной специфичности:
абсолютная субстратная специфичность - это способность фермента катализировать превращение только одного, строго определенного субстрата;
относительная субстратная специфичность - способность фермента катализировать превращения нескольких, сходных по строению, субстратов;
стереоспецифичность - способность фермента катализировать превращения определенных стереоизомеров.
Методы определения ферментативной активности микрооорганизмов.
