Глава 1. Обзор литературы

1.1.Разнообразие белков семейства кальпаинов

Протеолиз – один из универсальных процессов живой природы – в настоящее время рассматривается как основной механизм биологического контроля (Антонов, 1983; Kirschner, 2000). Современные методы белковой химии, молекулярной биологии и биоинформатики позволяют идентифицировать все большее число чрезвычайно разнообразных классов и семейств протеиназ, использующих различные механизмы катализа для гидролиза субстратов и приспособленных к широкому диапазону условий функционирования в различных организмах (Немова и др., 2008).

Кальпаины (КФ 3.4.22.17; клан CA, семейство C2) – кальцийзависимые протеиназы, ответственные за селективную деградацию белков в цитозоле эукариотических и, возможно, ряда прокариотических клеток (Rawlings et al., 2010). Термин “кальпаин” отражает чувствительность этих протеиназ к Са2+ и их сходство с папаином в области каталитического домена. По современной классификации пептидаз, разработанной создателями базы данных MEROPS (Rawlings et al., 2008) и учитывающей гомологию аминокислотных последовательностей и сходство структурной организации, кальпаины выделены в индивидуальное семейство С2 клана цистеиновых пептидаз CA. К настоящему времени идентифицированы уже 673 последовательности, кодирующие кальпаины и их гомологи. Принадлежность белка к семейству определяется сходством его последовательности в области каталитического папаиноподобного домена с аналогичной областью молекулы типичной протеиназы семейства – кальпаина 2 человека. (Немова и др., 2010.)

Наиболее полно охарактеризован кальпаин 2 человека, кодируемый геном CAPN2, – типичный фермент семейства С2 (Rawlings et al., 2008). Кальпаин 2 – субъединица более сложного фермента, m-кальпаина, который имеет структуру гетеродимера (Suzuki et al., 2004), состоящего из большой субъединицы молекулярной массой 80 кДа и малой – 30 кДа. На основании аминокислотной последовательности он подразделяется на четыре домена (I−IV) (Suzuki, 1990), по данным рентгеноструктурного анализа, в составе домена II выделяют два субдомена, а между доменами III и IV обнаруживается линкерная область (Strobl et al., 2000). N-концевой домен I, или пропептид, не блокирует стерически активный центр (Strobl et al., 2000), поэтому его аутокаталитическое отщепление не является необходимым условием для активации фермента. Каталитический домен II содержит типичную каталитическую триаду цистеиновых протеиназ. Домен III обеспечивает сопряжение каталитического домена II и Са2+-связывающего домена IV, а также усиление Са2+-индуцированных конформационных изменений. Последовательность домена IV имеет сходство с кальмодулином и содержит пять потенциальных Са2+-связывающих EF hand-мотивов (Strobl et al., 2000). Учитывая сопряженное действие доменов II−IV, механизм активации кальпаинов рассматривается как Са2+-индуцируемая междоменная аутоактивация.

Специфичность μ-кальпаина и m-кальпаина очень сходна, если не идентична (Goll et al., 2003). Как оказалось, они расщепляют одни и те же пептидные связи субстратных белков, например, α-тропомиозина, хотя степень расщепления может различаться. Степень расщепления кальпаинами некоторых белков в значительной мере зависит от фосфорилирования белкового субстрата, а в некоторых случаях изменению подвергаются сами расщепляемые сайты.

Cчитали, что первым кальпаином, который был выделен из скелетных мышц цыпленка (Ishiura et al., 1978), являлся m-кальпаин. Однако же, недавно проведенные клонирование и секвенирование показали, что это уникальный кальпаин, последовательность 80 кДа субъединицы которого в равной степени гомологична последовательностям 80 кДа субъединиц μ- и m-кальпаинов млекопитающих (Sorimachi et al., 1995b). Проведено клонирование и секвенирование кДНК μ-кальпаина из скелетных мышц цыпленка (Jeong et al., 1997), а также выделен кодируемый ею белок (Wolfe et al., 1989а). В мышцах цыпленка обнаруживаются два кальпаина с миллимолярной потребностью в Са2+, причем один из них при определенных условиях соэлюируется с μ-кальпаином, что свидетельствует том, что его молекулярная масса промежуточная между классическими μ/m-кальпаинами. Пока не установлено соответствие этого “высокомолекулярного m-кальпаина”, выделенного из мышц цыпленка (Wolfe et al., 1989а), и последовательности кДНК m-кальпаина цыпленка (Sorimachi et al., 1995b). “Промежуточный” тип кальпаина, названный μ/m-кальпаин, экспрессируется в различных тканях цыпленка (Sorimachi et al., 1995b) и является преобладающей формой кальпаина в скелетных мышцах (Wolfe et al., 1989а). В тканях млекопитающих ДНК или белок μ/m-кальпаина еще не идентифицированы, и пока неясно, присутствует ли он только у цыпленка или также и у других видов. В отличие от многих тканеспецифичных кальпаинов млекопитающих и кальпаин-подобных белков других организмов, μ/m-кальпаин достаточно хорошо изучен. Это гетеродимер, содержащий малую субъединицу28 кДа, подобную таковой μ- и m-кальпаинов, ему необходимы 420μMСа2+ для достижения половины максимальной протеолитической активности (Wolfe et al., 1989а).

Данные о кальпаин / кальпастатиновой системе у рыб до настоящего времени неполны. Исследования этой ферментной системы у холоднокровных животных, в отличие от теплокровных, проводятся не так активно, кроме того, отсутствуют данные полной расшифровки геномов большинства рыб. Есть данные о каталитических субъединицах μ и m-кальпаинов радужной форели (Немова и др., 1993; Бондарева, 2004,). Последовательность большой каталетической субъединицы μ-кальпаина включает 704 аминокислотных остатка (79,9 кДа). Последовательность большой субъединицы μ-кальпаина радужной форели включает 701 аминокислотный остаток (78,2 кДа) и идентична с субъединицей μ-кальпаина мыши на 66% (Salem et al., 2005) Структура больших субъединиц ферментов рыб типична для кальпаинов и включает 4 домена: I (пропептидный), II (каталитический домен цистеиновых протеиназ), III (электростатический сигнальный), IV (кальмодулин-подобный Са2+-связывающий).

Известно, что в мышцах окуня Dicentrarchus labrax L., определяются три пика (А, В и С) Са2+-зависимой протеолитической активности при нейтральном pH. Протеиназы по ряду свойств могут быть отнесены к кальпаин-подобным: цистеин-зависимые, активные при нейтральном рН и Са2+-зависимые. Согласно необходимой для активации концентрации Са2+, пик А пик соответствует μ-кальпаину, пики В и С –m-кальпаину. Многие свойства указывают на сходство кальпаинов рыб с кальпаинами млекопитающих, но существенны отличия по молекулярной массе и количеству представленных форм (Ladrat et al., 2000).

Еще одна особенность кальпаинов рыб (радужной форели, рыбы-зебра и японской камбалы) заключается в отличии их малой субъединицы от классической малой субъединицы μ- и m-кальпаинов млекопитающих. В ней отсутствует Gly-богатая область в домене V, необходимая для взаимодействия с мембранами (Schaad et al., 2002); эта характерная черта также свойственна позднее обнаруженной малой субъединице кальпаинов 2 (или css2) (Мa et al., 2004; Suzuki et al., 2004), однако, идентичность этих полипептидов пока не установлена. Эта структурная особенность предполагает иные механизмы функционирования и активации кальпаинов рыб (Salem et al., 2004).

Кальпаины рыб способны расщеплять in vitro индивидуальные белки миофибрилл, включая тяжелую цепь миозина, С-белок, тропомиозин, тропонины Т и I, белки промежуточных филаментов десмин и виментин (Dayton et al., 1975; ). Выделенный из скелетных мышц карпа m-кальпаин освобождает из состава миофибрилл α-актинин, солюбилизирует его и последовательно расщепляет субъединицы этого димера до более коротких фрагментов, однако, он не способен расщеплять α-актинин в составе миофибрилл (Tsuchiya and Seki, 1991).

В эритроцитах рыб (карпа, форели и других) содержится гомолог кальпаинов, по чувствительности к Са2+ идентифицированный как m-кальпаин (Nemova et al., 2000; Toyohara et al., 1985). Есть данные (Goll et al., 2003), что обычно в эритроцитах млекопитающих кальпаины представлены только μ-кальпаином, а в эритроцитах птиц обнаруживается промежуточная по чувствительности к Са2+ форма кальпаина.