Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Петрозаводский Государственный Университет»

(ПетрГУ)

Эколого-биологический факультет

Кафедра молекулярной биологии, биологической и органической химии

Прокопенко

Христина Николаевна

Специальность

«Биология»

АКТИВНОСТЬ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНАЗ В МОЗГЕ КРЫС

С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ НЕЙРОПАТОЛОГИЕЙ

Дипломная работа

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

ведущий научный сотрудник ИБ КарНЦ РАН

Лысенко Людмила Александровна

Петрозаводск, 2015.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Кальпаин/кальпастатиновая протеoлитическая система

1.2 Биохимические механизмы развития нейродегенеративных заболеваний

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Реагенты и приборы

2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных

2.3 Анализ биохимических показателей

2.3.1 Экстракция белков из тканей

2.3.2 Определение активности кальпаинов

2.3.3 Зимография с казеином

2.3.4 Электрофорез белков полиакриламидном геле

2.3.5 Вестерн-блот анализ

2.3.6 Другие методы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенирации на фоне эстрогенной терапии

3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенирации на фоне терапии потенциальными нейропротекторами

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Нейродегенеративные заболевания ‒ болезни Альцгеймера, Паркинсона и другие – представляют в странах с высокой продолжительностью жизни населения огромную медицинскую, социальную, финансовую и научную проблему. Распространенность этих заболеваний растёт по мере старения населения, и большинство развитых стран уже сейчас оказывают специальную поддержку исследованиям в области изучения нейродегенеративных заболеваний.

К настоящему времени участие внутриклеточных протеиназ в нейродегенеративных процессах не вызывает сомнений. С одной стороны, недостаточная интенсивность протеиназозависимых процессов при нейродегенеративных заболеваниях способствует накоплению большого количества патологических белков, например, бета-амилоида и тау-протеина при болезни Альцгеймера, альфа-синуклеина при болезни Паркинсона и других. С другой стороны, протеиназы регулируют основные пути гибели клеток при нейродегенерации – апоптоз, некроз и аутофагию. Таким образом, для нервной ткани жизненно важно поддержание тонкого баланса активности протеиназ, при этом может быть необходимым как повышение их активности для разрушения патогенных белков, так и снижение – для предотвращения массовой гибели нейронов. Са²⁺-зависимые протеиназы, или кальпаины, относящиеся к семейству С2 цистеинового типа, представлены в тканях ЦНС пятью ферментами – основными μ- и m-кальпаинами (КФ 3.4.22.52 и 3.4.22.53, соответственно) и минорными кальпаинами 3, 5 и 10. Участие Са²⁺-зависимых протеаз в нейродегенеративных процессах – общебиологическое явление, обнаруживаемое у широкого круга организмов – от нематоды С. elegans до приматов.

В силу особенностей биологии (неспособность к митозу) нейроны особенно чувствительны к накоплению недеградированных продуктов белкового обмена, в норме эффективно разрушаемых внутриклеточными протеиназами. Известно, что в нормальных условиях более 25% синтезированных de novo клеточных белков содержат ошибки и подвергаются быстрому разрушению. Ослабление протеиназоассоциированной функции контроля качества клеточных белков (в силу нарушения синтеза и/или регуляции протеиназ из-за сенильных изменений или при действии неблагоприятных экзогенных или эндогенных факторов) приводит к накоплению клеточных белков с ошибками биосинтеза и с нарушенной конформацией. Дефектные белки нефункциональны, участвуют в аберрантных взаимодействиях, образуют нерастворимые белковые агрегаты и приобретают свойства цитотоксичности. В связи с этим, проект направлен на изучение роли внутриклеточных протеиназ в механизмах возрастной и патологической нейродегенерации.

Целью экспериментальной и теоретической работы было изучение роли внутриклеточных кальцийзависимых протеиназ (кальпаинов) в развитии индуцированных нейродегенеративных нарушений и механизмов торможения кальпаинозависимых этапов нейродегенерации путём введения нейропротекторов. Объект исследования - лабораторные крысы- биомодели нейродегенеративных патологий человека. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) анализ литературных источников по проблеме разнообразия молекулярных форм кальпаинов в тканях млекопитающих, их эндогенных регуляторов и роли кальпаиновой системы в развитии нейродегенеративных процессов;

2) освоение методических приёмов выделения кальцийзависимых протеиназ из тканей животных, разделения их молекулярных форм, определения протеолитической активности, количественной оценки уровня ингибитора кальпастатина;

3) проведение экспериментов с лабораторными животными: индуцирование нейродегенерации путём введения экзогенных веществ, её коррекция потенциальными нейропротекторами, проведение поведенческих тестов, взятие биологического материала (органов крыс) для биохимического анализа;

4) биохимический анализ протеолитической активности разных молекулярных форм кальпаинов и количественная оценка их ингибитора - кальпастатина в нервной ткани крыс разных экспериментальных групп;

5) анализ результатов об участии кальпаинов и их регуляторов в развитии индуцированной нейропатологии и возможности купирования кальпаинозависимых нарушений потенциальными нейропротекторами.