Питательные среды и особенности выращивания растительных клеточных культур.

В отличие от животной клетки, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования. Существуют общие требования к выращиванию объектов in vitro. Это, прежде всего асептика, которая необходима и обязательна для культивирования, как отдельных клеток, так и каких-либо фрагментов ткани или органа растения (экспланта). Кроме того, для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры необходимо учитывать влияние физических факторов на рост и физиологические характеристики этой культуры на уровне фенотипа и генотипа.

Искусственные питательные среды, содержат ауксины: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг/л, в зависимости от вида экспланта. Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях происходит независимо от принадлежности растений к той или иной таксономической группе.

Методы культивирования изолированных клеток и тканей для получения БАВ.

Культура каллусных тканей, или культура тканей. Суспензионная культура. Культивирование отдельных клеток.

Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенные на твердой (агаразованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. Для производства биологически активных веществ (БАВ) используют каллусную ткань, которую получают твердофазной ферментацией и глубинным суспензионнным культивированием. Каллусная культура – это неорганизованная профилирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего начинается старение и отмирание клетки. Для того чтобы не произошло старения, первичный каллус через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.

Суспензионные культуры состоят из отдельных клеток, имеющих различную форму и размеры, и неоднородных многоклеточных агрегатов. Соотношение отдельных клеток и таких агрегатов в суспензии зависит от видовой принадлежности растения и условий культивирования. Глубинное культивирование осуществляют в колбах на качалках при частоте вращения 100-120 об/мин. В лабораторных условиях используют сосуды объемом 100-250 мл с небольшим объемом питательной среды. Для синхронизации клеточных культур используют методы индукции, когда происходит остановка клеточного цикла в определенном периоде под воздействием химических (тимидин, 5-аминоурацил, оксимочевина) или физических факторов (создание условий «голодания» по одному из компонентов питательной среды).

Фазы ростового цикла в суспензионной культуре.

Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму Различают следующие фазы ростового цикла:

1. Латентная фаза (лаг-фаза). В этот период клетки не размножаются, отсутствует их видимый рост, но происходит активный процесс поглощения воды и питательных веществ.

2. Экспоненциальная (логарифмическая фаза роста). Ограниченный период в ростовом цикле, когда происходит увеличение количества клеток за счет их интенсивного деления.

3. Линейная фаза. Очень короткая фаза ростового цикла. Удельная скорость роста культуры в этой фазе практически постоянна.

4. Фаза замедленного роста (ранняя стационарная фаза). В этот период средний размер клеток продолжает возрастать, отмечается гетерогенность клеточной популяции и начало синтеза вторичных веществ.

5. Стационарная фаза. Культуральная среда истощается по наличию основных компонентов, необходимо проводить субкультивирование суспензионной культуры на свежую среду.

6. Фаза деградации клеток. Метаболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останавливают.

Промышленное выращивание клеточных культур и преимущества их использования.

Из сравнения каллусных и суспензионных культур следует, что выход продуктов вторичного метаболизма выше в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе с суспензионными культурами. Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор части суспензии и разбавление оставшейся суспензии свежей средой. Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы, свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии.

Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем:

• Решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов растений, не поддающихся плантационному культивированию;

• Возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.;

• Имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением;

• Возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами;

• Имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог.

Иммобилизация клеток и тканей растений, получение вторичных метаболитов на их основе. Преимущества иммобилизованных растительных клеток перед традиционными способами культивирования. Система культура с плоской основой.

Система колончатой культуры

Новым подходом, направленным на увеличение выхода вторичных метаболитов, является иммобилизация клеток и тканей растений. Клетки помещают в определенные носители: альгинат кальция, агарозные шарики, трехмерные сетчатые структуры из нейлона и т.д. Такие биологические системы более устойчивы к механическим повреждениям, при этом фаза роста клеток совпадает с фазой образования продукта; клетки легко переносятся в новую среду или иные условия культивирования. Основные условия иммобилизации - выделение метаболитов в питательную среду и свободное их извлечение.

Методы иммобилизации клеток делят на 4 категории:

1. Иммобилизация клеток или субклеточных органелл в инертном субстрате (Catharanthus roseus L., Digitalis lanata L.).

2. Адсорбция клеток на инертном субстрате. Метод применялся в экспериментах с животными клетками, а также клетками Saccharomyces uvarum, S. cerevisiae, Candida tropicalis, E. coli.

3. Адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул (таких, как лектин). Применяется редко, есть сведения об экспериментах с различными линиями клеток человека, эритроцитами крови барана.

4. Ковалентное связывание с другим инертным носителем, типа КМЦ (натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы). В основном проводились эксперименты по иммобилизации клеток животных и микроорганизмов.

Клетки, иммобилизованные на плоской основе, имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов, однако горизонтальная конструкция при промышленном культивировании создает неудобства при работе и требует большей площади, что устраняется в системе колончатой культуры.

Биотрансформация. Биотрансформация стероидных

гликозидов на примере Digitalis lanata.

Довольно часто синтез метаболитов в суспензионной культуре останавливается на промежуточных этапах, не доходя до получения необходимого конечного продукта. В этом случае получение целевого продукта возможно, благодаря процессу биотрансформации, суть которого заключается в изменении промежуточных метаболитов с помощью культур других растений или клеток бактерий с целью получения биологической активности конкретной химической структуры. Хорошо изученной системой, на примере которой можно проиллюстрировать способность процесса биотрансформации повысить активность вещества, является превращение дигитоксина в дигоксин за счет реакции β -12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, содержащимся в клетках наперстянки Digitalis lanata L. Дигитоксин и дигоксин принадлежат к группе стероидов, известных, как «карденолиды», применяемые в медицине для лечения сердечных заболеваний.