Методы сохранения клеточных культур.

Анабиоз и основные закономерности анабиоза.

Различные подходы сохранения клеточных культур.

Под анабиозом понимают способность биологических объектов обратимо приостанавливать или предельно затормозить процессы их жизнедеятельности. Выделяют следующие основные признаки анабиотического состояния:

• отсутствие или предельное затормаживание метаболизма;

• сохранение структуры в течение продолжительного времени;

• отсутствие в жидкой фазе заметных количеств свободной воды как непрерывной среды;

• повышенная устойчивость к экстремальным факторам;

• способность восстанавливать процессы жизнедеятельности.

Существует разные подходы к сохранению культур: криосохранение, замедление роста, сушка (распылительная и лиофильная) – широко применяемое в микробиологии для клеток микроорганизмов, в настоящее время неприемлемо для культур тканей высших растений.

Наука криобиология и криосохравнение. Факторы, влияющие на успех низкотемпературной консервации. Методы криосохранения.

Криосохранение (от греческого криос – мороз) - хранение в замороженном состоянии. Однако на практике обычно это хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (-79^оС), в морозильниках с ультранизкой температурой (-80^оС и ниже), в парах (приблизительно -140^оС) или непосредственно в жидком азоте (-196^оС). Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196^oC. Низкотемпературная консервация зависит от: вида и типа клеток; их концентрации в суспензии; состава среды для консервирования; вида и концентрации криопротектора; режима охлаждения и отогрева, а также способа реабилитации клеток после отогрева.

Реакция клеток на низкую температуру. Холодовый шок.

Устойчивость к холоду и морозостойкость. Факторы, влияющие на процесс замерзания.

Термин «холодовой шок» (повреждение от охлаждения) используют для описания чувствительности ткани к понижению температуры. Холодовый шок часто связан со скоростью охлаждения: быстрое охлаждение обычно вызывает более значительные повреждения, чем медленное. К основным факторам, влияющим на процесс замерзания, относятся; переохлаждение, образование кристаллов льда, концентрирование растворенных в воде веществ, сжатие клеток, внутриклеточный лед. Повреждения можно уменьшить или преодолеть введением в среду криопротекторов, специфических фосфолипидов или различных других соединений или изменение концентрации специфических анионов.

Факторы, влияющие на выживаемость клеток, хранящихся при низких температурах. Двухступенчатое охлаждение. Витрификация. Криопротекторы.

К факторам, влияющим на выживаемость клеток, хранящихся при низких температурах относятся: скорости охлаждения, криопротекторы, витрификация, оттаивание, обработка после оттаивания.

Двухступенчатое охлаждение - метод предварительного замораживания клеток быстрым охлаждением до температуры ниже нуля при кратковременном выдерживании их при этой температуре перед быстрым охлаждением до температуры хранения. При достаточно быстром охлаждении водного раствора время, необходимое для роста кристаллов льда, ограничено, и раствор остается аморфным. Ниже определенной температуры (т.е. точки перехода в стекловидное состояние) это условие становится стабильным, и раствор витрифицируется. Криопротекторы - гетерогенная группа соединений, которые ослабляют эффект кристаллизации, изменяя её характер, препятствуют слипанию и денатурации макромолекул, способствуют сохранению целостности мембран клеток. Криопротекторы условно разделяют на две группы: проникающие и непроникающие соединения.

Оттаивание. Обработка после оттаивания. Оценка жизнеспособности

клеток после криосохранения.

Повреждение при оттаивании происходит главным образом в результате «блуждающей» рекристаллизации, т.е. роста маленьких кристаллов льда, образуемых при охлаждении. Быстро охлажденные клетки чаще содержат внутриклеточный лед, и, следовательно, быстрое оттаивание должно обеспечить лучшее выживание, чем медленное. Было получено прямое доказательство роста внутриклеточного льда при медленном оттаивании. Существует и другой возможный механизм повреждения при оттаивании. Как предполагают, существует разница в химическом потенциале внутри и снаружи клетки, обусловленная различием размеров кристаллов льда в этих двух пространствах, что приводит к образованию движущей силы для перемещения воды через клеточную мембрану. Такое движение воды и (или) возникающее в результате этого увеличение содержания осмотиков внутри клетки, очевидно, и вызывает повреждения клеток. Для клеток после оттаивания нужен особый уход. Добавление в среду определенных веществ, например сыворотки или непроникающих веществ, часто может значительно уменьшить стресс разведения, препятствуя быстрому осмотическому притоку воды, в то время как криопротектор диффундирует наружу. Однако во многих случаях полное удаление криопротектора нежелательно, и продолжительное промывание может еще больше травмировать клетки.

Для определения выживаемости клеток, тканей, органов или организмов после низкотемпературного хранения существует много специфических методов. Определенным тестом на выживание, его количественной оценкой, является рост после восстановления, хотя для быстрой оценки пригоднее тест на жизнеспособность. Качественные оценки требуют соответствующих анализов. Существуют три теста на жизнеспособность. Первые два используются для образцов, видимых под микроскопом в проходящем свете, т.е. клеточных суспензий, протопластов, небольших каллусных и организованных структур. Третьий, ТТХ-тест, удобен для клеток, каллусов и плотных, относительно крупных организованных структур, однако он недостаточно эффективен на зеленом материале.

Основные достижения в хранении культур тканей растений.

Сохранение in vitro генофонда.

Живая ткань в любой форме представляет собой незаменимый генетический материал, который требует хранения и последующего использования. Методические достижения в области криобиологии позволяют успешно сохранять живые ткани длительное время (протопласты, пыльца, суспензионные культуры клеток, культуры каллусов, зародышей, культуры верхушек побегов), а затем использовать их в различных биотехнологических целях. Разработка методов культивирования клеток и тканей в условиях in vitro позволила использовать их для сохранения генофонда различных растительных объектов. Дополнительное достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro - возможность разместить на 1м² площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.