Факторы, влияющие на скорость деления клеток в клеточной культуре.

Ведение клеточных линий требует постоянного увеличения количества клеток, поэтому выбор условий культивирования направлен на обеспечение максимальной скорости клеточной пролиферации. К условиям, способствующим размножению клеток, относятся их низкая плотность, невысокая концентрация Ca²⁺, присутствие ростовых факторов. Высокая плотность клеток (выше 10⁵ клеток на 1 см²) и концентрация Ca²⁺ (300—1500 мкмоль); присутствие индукторов дифференцировки (гормоны, например гидрокортизон, фактор созревания глии, фактор роста нервов, ретиноиды; и полярные растворители, в частности диметилсульфоксид) способствуют прекращению клеточного деления и индуцируют дифференциpoвку клеток.

Основные системы культивирования клеток.

Существует две основных системы клеточных культур:

1. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки вводят в фиксированный объем среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток.

2. Проточные культуры - культура, в которой производится постоянное продвижение (поступление и выведение) жидкой фазы. Обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Суспензионные культуры в отличие от монослойных культур предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.

Культуры клеток можно культивировать:

1. В плоских флаконах (матрацах).

2. Во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.

3. В колонках на «микроносителях» (Van Werel, 1967), в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.

4. На трёхмерных подложках-носителях естественного или искусственного происхождения с целью пространственного формирования будущего клеточного трансплантата (скаффолд-технология).

Гибридизация животных клеток. Получение клеточных гибридов

в естественных и искусственных условиях.

Еще в начале ХIX века было высказано предположение, что соматические клетки могут сливаться друг с другом, однако гибриды соматических клеток были открыты лишь в 60-х годах XX века. В 1960 г. Барский с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток. Гибридные клетки были получены путем смешения двух линий, выделенных ранее из 1 клетки мышиной саркомы. Установлено, что клеточные гибриды можно получить, используя клетки различных видов животных.

Методы создания химер.

К методам создания экспериментальных химер относят:

Агрегационный метод (Тарковский, Минц, 1960-1962), позволяющий получать химеры не только между двумя эмбрионами, но и между различным числом изолированных бластомеров или отдельными частями эмбрионов. Преимущество метода - не требует вмешательства микрохирургической техники, поэтому широко используется в эмбриогенетике.

Иньекционный метод (Гарднер, 1968), основанный на использовании эмбрионов на стадии бластоцисты и нашедший применение при получении межвидовых химер. Химерные животные не передают потомкам генетическую мозаичность. У них происходит расщепление, как у гетерозигот, поэтому ценные генетические комбинации нарушаются.

Механизм слияния клеток. Вещества, индуцирующие слияние клеток.

1 этап - сближение мембран соседних клеток и установление между ними тесного контакта. 2-й этап - выход гликопротеидов и обнажение липидных слоев мембраны. 3-й этап - образование мицелл. Начало 4-го этапа - слияние мембран, образование цитоплазматических мостиков. Для индукции слияния клеток используются вещества различной природы: ионы Са²⁺, полиэтиленгликоль, лизолецитин, моноолеат глицерина, вирус Сендай. К другим агглютинирующим агентам относятся лектины растений и антитела.

Клонирование животных. Методы трансплантации ядер.

Клонирование млекопитающих.

Перенос ядер соматических клеток довольно часто не совсем корректно называют клонированием. Перенос ядер соматических клеток – технология создания клетки, которая вдет себя как эмбриональная стволовая клетка (ЭСК), но содержит генетический материал, полученный от взрослой клетки. Процесс начинается с оплодотворенной яйцеклетки и соматической клетки, взятой от взрослого организма. Донор оплодотворенной яйцеклетки и донор соматической клетки не должен быть одним и тем же индивидуумом. Ядро оплодотворенной яйцеклетки удаляется и заменяется ядром соматической клетки. Соматическая клетка теоретически может быть любым типом клетки: от костного мозга до кожи. Яйцеклетка развивается в зиготу, а линия эмбриональных стволовых клеток образуется из бластоциста, как в случае развития любой линии ЭСК. Теоретически возможно имплантировать новую яйцеклетку с ядром соматической клетки в матку, и она разовьется в целостный организм (клон), полностью идентичный организму, от которого была получена соматическая клетка.

Перенос ядер соматических клеток интенсивно использовался при клонировании животных. В 1996 году родилась овечка Долли – первый успешный клон, произошедший от клетки взрослого организма. С тех пор с использованием этой технологии ученые клонировали тысячи особей крупного рогатого скота, мышей и других животных. Использование технологии переноса ядер соматических клеток имеет несколько ограничений. Животные, полученные методом клонирования, имеют высокий процент выкидышей на поздних сроках беременности и рождения детёнышей с врожденными дефектами, свидетельствующее о том, что клеточная трансформация не лишена недостатков.