- •Современные методы исследования биологически активных веществ
- •Современные методы исследования биологически активных веществ
- •1. Общие положения
- •1.1 Спектральные методы анализа
- •1.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •1.2.1 Преимущества метода
- •1.2.2 Основной принцип хроматографического разделения.
- •1.2.3 Устройство жидкостного хроматографа
- •1.2.3.1 Насосы
- •1.2.3.2 Устройство для формирования градиента
- •1.2.3.3 Инжекторы
- •1.2.3.4 Детекторы для вэжх
- •1.2.3.5 Сосуды для подвижной фазы
- •1.2.3.6 Колонки
- •2 Методики выполнения лабораторных работ
- •2.1 Спектрофотометрическое определение витамина в6 (пиридоксина гидрохлорида) 5% в инъекционных препаратах
- •2.2 Метод рн дифференциальной спектрофотометрии определения массовой доли суммы антоцианинов в соковой продукции.
- •2.3 Спектрофотометрическое определение количественного содержания аскорбиновой кислоты (витамина с) в напитках.
- •2.4 Определение содержания витаминов в1, в2 методом вэжх в премиксах.
- •2.5 Определение содержания и состава углеводов с помощью метода вэжх.
- •2.5.1 Основы ионообменного метода
- •2.5.2 Выбор подвижной фазы и условий разделения.
- •2.5.3 Проведение испытания
- •3. Список рекомендуемой литературы
1.2.3.4 Детекторы для вэжх
Детекторы для ВЭЖХ служат для фиксирования изменений каких-либо свойств растворителя, выходящего из колонки. Как правило эти изменения связаны с наличием в растворителе анализируемых веществ. Это может быть изменение оптических свойств элюента (в ИК, УФ или видимой области), его показателя преломления, способности флюоресцировать, электропроводности, способности окисляться или восстанавливаться, диэлектрической проницаемости и т.д. Чаще всего применяют следующие типы детекторов.
Детекторы с переменной длиной волны представляют собой спектрофотометры, работающие в ультрафиолетовом и видимом диапазоне длин волн. Детекторы имеют чувствительность 5∙10-10 г/см 3 и линейный диапазон 105 Все спектрофотометрические детекторы имеют проточные ячейки с малым внутренним объемом (обычно 8 мм3 ) и длиной оптического пути 10 мм, что позволяет осуществлять непрерывный мониторинг на выходе из колонки.
Флуоресцентный детектор чрезвычайно удобно использовать в ВЭЖХ, поскольку он гораздо более чувствителен (10-12 г/см3 ), чем детектор, работающий в УФ диапазоне, однако его линейный диапазон немного уже (104 ). К сожалению, область применения таких детекторов ограничена сравнительно небольшим числом флуоресцирующих веществ. Проведение предварительной дериватизации образцов может расширить границы применимости метода.
Электрохимические детекторы используют для анализа электроактивных веществ и являются довольно чувствительными. Существуют два типа таких детекторов со сходными принципами действия – амперометрические и кулонометрические. В проточной ячейке расположены два электрода: противоэлектрод (Ag/AgCI или каломельный) и рабочий электрод. На противоэлектрод подается постоянный потенциал такой величины, что при прохождении веществ через ячейку они окисляются или восстанавливаются на его поверхности, в результате чего между электродами возникает электрический ток. Величина этого тока регистрируется и записывается в виде хроматограммы.
Большее предпочтение отдается амперометрическим детекторам, поскольку они обладают большей чувствительностью (10-12 г/см3 против 10-8 г/см3 )и более протяженным линейным диапазоном (105 против 104). Для восстановительных реакций в качестве рабочего электрода используется ртутный электрод , а для окислительных реакций –электрод из углерода или углеродных компонентов.
К способным окисляться веществам относятся углеводороды, амины, амиды, фенолы, ди и триазины, фенотриазины, катехоламины и хинолины.
Подразделяются детекторы на селективные и универсальные.
Селективные детекторы фиксируют элюирование интересующих исследователя веществ, которые обладают специфическими свойствами, на фоне многих других компонентов, этими свойствами не обладающих. Эти детекторы (флуоресцентный, электрохимический и др.) широко применяются для анализа следовых количеств лекарственных препаратов в биологических образцах, биогенных аминов и микропримесей,.
Универсальные детекторы реагируют на элюирование любых веществ вне зависимости от того, обладают они какими-то особыми свойствами или нет. Такие детекторы широко применяются в нефтехимии, органической химии, химической, медицинской фармацевтической, промышленности, биологических науках.
Примером универсального детектора может служить рефрактометрический детектор. Дифференциальный рефрактометр непрерывно регистрирует изменение показателя преломления элюата (дифференциальное измерение показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе) на выходе из колонки.
Главным достоинством детектора является то, что при выборе подходящего растворителя он может детектировать любые вещества. К другим достоинствам рефрактометра относятся возможность работы с любыми растворителями в широком интервале скорости потока, невысокие требования к чистоте подвижной фазы, надежность и удобство в эксплуатации. Некоторые модели детекторов могут работать при температуре до 150 °С, что является исключительно важным для эксклюзионной хроматографии ряда синтетических полимеров. Поэтому он занимает второе место по частоте использования (после УФ - детекторов).
Чувствительность этих детекторов к изменениям температуры для разных растворителей составляет от 5∙10-4до 5∙10-5единиц показателя преломления (е.п.п.) на 1° С, а к изменениям давления – (1-5)∙10-4 е.п.п./МПа.