Карабинцева Фармацевтическая технология методички / Краткий курс биотехнологии
.pdf
Для получения препаратов иммуноглобулина применяют метод Кона, метод фракционирования белков этиловым спиртом.
Применяются различные модификации этого метода, фракционирование проводится при низкой температуре.
Для гарантии исключения вирусной контаминации в современном производстве применяют дополнительные методы обезвреживания сывороточных препаратов: пастеризацию, обработку хлороформом, полиэтиленгликолем, (3-пропиолактоном, ультрафиолетовое облучение и пр.).
По европейской фармакопеи и национальным требованиям содержание фрагментов иммуноглобулина не должно превышать 5 %, а содержание агрегатов — 10 %.
Нормальный иммуноглобулин, полученный по методу Кона, состоит, в основном, из IgG.
IgM и IgA остаются в балластных фракциях, хотя они содержат антитела, играющие важную роль в развитии иммунитета против бактериальных и вирусных инфекций.
Для получения обогащенных препаратов используются дополнительные методы фракционирования и очистки иммуноглобулинов с помощью методов ионообменной хроматографии, адсорбционной хроматографии, ультрафильтрации и пр., а также дополнительныеметоды ихобезвреживания.
В России выпускаются комплексные препараты иммуноглобулина для перорального и местного применения.
Иммуноглобулины являются ценным средством профилактики и лечения всех инфекционных заболеваний, при которых развитие иммунитета зависит от циркулирующих антител.
Разрабатываются новые препараты иммуноглобулинов против вирусов краснухи, герпеса, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, цитомегаловируса Коксаки и др.
Тормозит производство — отсутствие надежных коммерческих диагностикумов, необходимых для отбора донорских сывороток по титрам антител.
Перспективным источником создания специфических иммуноглобулиновых препаратов являются моноклональные антитела, они обладают узкой специфичностью и могут быть получены в большом количестве.
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
101
|
|
|
________________________________ |
|
|
Отечественные сывороточные препараты, при- |
________________________________ |
||
|
меняемые для профилактики и лечения |
|
||
|
заболеваний |
|
________________________________ |
|
|
Гомологичные препараты |
|||
|
________________________________ |
|||
|
Плазма противопротейная, антистафилококковая и |
|||
|
||||
|
против синегнойной палочки. |
________________________________ |
||
|
Иммуноглобулин нормальный для внутримышеч- |
|||
|
ного и внутривенного введения. |
________________________________ |
||
Специфические иммуноглобулины против боту- |
||||
|
лизма, гепатита В, гриппа, клещевого энцефалита, |
________________________________ |
||
|
коклюша, стафилококковых инфекций, столбняка. |
|||
Иммуноглобулин противоаллергический, гиста-
глобулин, гистасероглобулин. ________________________________
|
Гетерологичные препараты |
|
|
________________________________ |
||
|
Сыворотки лошадиные против ботулизма, гангре- |
________________________________ |
||||
|
ны, дифтерии, столбняка. |
|
|
|||
|
Иммуноглобулины лошадиные против бешенства, |
|
||||
|
клещевого энцефалита, лихорадки Эбола, сибир- |
________________________________ |
||||
|
ской язвы, японского энцефалита, венесуэльского |
|
||||
|
энцефаломиелита лошадей. |
|
|
________________________________ |
||
Иммуноглобулин из сыворотки крови волов для |
|
|||||
|
лечения лептоспироза. |
|
|
________________________________ |
||
Иммуноглобулин антилимфоцитарный. |
|
|
|
|||
Сыворотки против яда змей. |
|
|
________________________________ |
|||
|
Лактоглобулины: против условно-патогенных бак- |
|||||
|
||||||
|
терий и сальмонелл, против протея и кишечной |
________________________________ |
||||
|
палочки. |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
________________________________ |
|
|
|
|
|
|
||
|
Основные пути научного поиска и повышения |
________________________________ |
||||
|
качества существующих сывороточных |
|
||||
|
препаратов : |
|
|
|
________________________________ |
|
|
Расширение ассортимента специфических имму- |
|||||
|
________________________________ |
|||||
|
ноглобулинов человека. |
|
|
|
||
Отказ от применения гетерологичных препаратов. |
________________________________ |
|||||
Повышениеспецифической активности препаратов. |
________________________________ |
|||||
Очистка от неспецифических биологически актив- |
||||||
|
ных веществ (групповых веществ крови, транс- |
|
||||
|
плантационных антигенов и пр.). |
свойств |
________________________________ |
|||
Повышение |
стабильности физических |
|
||||
|
препаратов, предупреждение расщепления и агре- |
________________________________ |
||||
|
гации молекул иммуноглобулина. |
|
|
|
||
|
Использование дополнительных методов инакти- |
________________________________ |
||||
|
вации возможной вирусной контаминации. |
|
||||
|
Разработка препаратов, обогащенных иммуногло- |
________________________________ |
||||
|
булинами классов IgA и IgM. |
|
|
|
||
|
Разработка новых методов получения иммуногло- |
________________________________ |
||||
|
булинов и новых видов антител (моноклональных, |
|
||||
|
генноинженерных, антиидиотипических и др.). |
________________________________ |
||||
|
Разработка |
высокочувствительных |
экспресс- |
|||
|
||||||
|
методов для анализа состава иммуноглобулинов в |
________________________________ |
||||
|
коммерческих препаратах. |
|
|
|||
|
В России препараты иммуноглобулинов выпуска- |
________________________________ |
||||
|
ют более 20 предприятий и около 50 станций пере- |
|||||
|
ливания крови. |
|
|
________________________________ |
||
|
|
|
|
|
||
102
Иммуноглобулины человека нормальные
В нормальном иммуноглобулине присутствуют антитела к вирусам гриппа, кори, гепатита А и В, ветряной оспы, краснухи, полиомиелита, возбудителям дифтерии, столбняка, антитела к стрептококку, стафилококку, пневмококку, менингококку, многим представителям энтеробактерий и другим микроорганизмам и их токсинам.
Уровень антител в препаратах колеблется в зависимости от эпидемиологической ситуации в регионах, где производятся препараты. Содержание антител в нормальном иммуноглобулине контролируется по уровню одного противовирусного и одного бактериального вида антител.
Благодаря наличию в препаратах иммуноглобулина факторов неспецифического иммунитета (факторов системы комплемента, цитокинов и др.), применение иммуноглобулина может усиливать неспецифическую резистентность организма.
Нормальный иммуноглобулин извлекают из пула плазмы крови, полученной не менее чем от 1000 здоровых людей. В состав нормального иммуноглобулина входит до 95 % IgG. Антитела к ВИЧ, вирусу гепатита С и HBsAg должны отсутствовать. Отечественные препараты не содержат мертиолята, антибиотиков и других консервантов.
Иммуноглобулиныдля внутримышечного введения
Отечественные препараты нормального иммуноглобулина применяются для экстренной специфической профилактики кори, гепатита А, коклюша, полиомиелита, менингококковой инфекции, для повышения неспецифической резистентности организма.
Иммуноглобулины для внутривенного введения
Коммерческие препараты иммуноглобулина для местного введения обладают антикомплементарной активностью в связи с присутствием в них белковых агрегатов. Такие препараты не используют для внутривенного введения, так как белковые агрегаты связывают большое количество сывороточного комплемента.
Для снижения антикомплементарной активности применяют различные способы предотвращения образования белковых агрегатов и их удаления. Для предупреждения агрегирования используют различного рода стабилизаторы, пригодные для внутривенного введения (полиэтиленгликоль, человеческий сывороточный альбумин, химически модифицированная желатина, сахара и др.).
Иммуноглобулин нормальный для внутривенного введения применяется для лечения тяжелых форм бактериально-токсических и вирусных инфекций, послеоперационных осложнений.
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
103
Иммуноглобулины человека нормальные (продолжение)
Иммуноглобулины для перорального введения
Иммуноглобулин, обогащенный IgM, человеческий для перорального применения сухой (Россия) применяется для лечения диарей, энтероколитов, дисбактериозов, вызванных патогенными и услов- но-патогенными бактериями.
Представляет собой белковую фракцию сыворотки или плазмы крови человека, содержащую иммуноглобулины классов М, G и А в смеси с пектином.
Препарат обладает широким спектром антибактериального действия, особенно в отношении грамотрицательных бактерий (шигелл, сальмонелл, патогенных кишечных палочек, синегнойной палочки, клебсиелл и др.).
Иммуноглобулиновый комплексный препарат для энтерального применения сухой (Россия). Препа-
рат применяется с одномесячного возраста для лечения острых кишечных инфекций, вызванных энтеробактериями. Препарат представляет собой комплекс иммуноглобулинов классов G, А и М, выделенных из плазмы крови доноров (КИП).
Специфические иммуноглобулины человека для профилактики и лечения инфекционных заболеваний
В практике российского здравоохранения используются два десятка сывороточных препаратов, полученных от людей-доноров или лиц, переболевших инфекционными заболеваниями или иммунизированных соответствующими вакцинами, а также от иммунизированных животных.
Для получения специфического иммуноглобулина от лиц, отобранных путем скрининга индивидуальных образцов сыворотки крови по титрам антител, применяют плазмаферез.
Уровень антител в препаратах специфического иммуноглобулина должен быть в 6–10 раз выше по сравнению с концентрацией антител в нормальном иммуноглобулине.
Специфические иммуноглобулины человека для профилактики и лечения инфекционных заболеваний (ассортимент)
Иммуноглобулин против гепатита В.
Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита жидкий.
Иммуноглобулин антистафилококковый жидкий.
Иммуноглобулин противостолбнячный.
Иммуноглобулин противококлюшный антитоксический.
Иммуноглобулин человека антиротавирусный для энтерального применения.
Иммуноглобулин противогриппозный.
Иммуноглобулины противоботулинические.
С лечебной целью применяют также антистафилококковую, антипротейную и антисинегнойную специфическую иммунную плазму человека.
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
104
Иммуноглобулины человека для лечения аллергических заболеваний
Противоаллергический иммуноглобулин отбирается путем скрининга из готовых полуфабрикатов донорского нормального иммуноглобулина по его способности защищать морских свинок от смертельного анафилактического шока на модели пассивной системной анафилаксии в 100 % случаев.
Иммуноглобулин противоаллергический. Препарат, основу которого составляет IgG, применяется для лечения аллергических заболеваний (поллинозы, атопическая форма бронхиальной астмы, рецидивирующая крапивница, отек Квинке, аллергодерматозы, дерматореспираторный синдром и др.).
Гистаглобулин сухой. Применяется для лечения аллергических заболеваний: хронической рецидивирующей крапивницы, атопических дерматитов, экземы, при невозможности применения специфической терапии аллергенами, аллергической риносинусопатии и конъюнктивитов, поллинозов, рецидивирующих отеков Квинке (за исключением наследственных форм).
Гетерологичные специфические сыворотки и иммуноглобулины для профилактики и лечения инфекционных болезней
Гетерологичные препараты получают из сыворотки крови животных, чаще лошади, иммунизированных определенной вакциной или специальным антигеном.
Препараты содержат антитела, действующие на возбудитель заболевания и нейтрализующие его токсины. Гетерологичные препараты должны быть максимально очищены от балластных белков и подвергнуты концентрации.
Гетерологичные препараты индуцируют образование антител, которые взаимодействуют с введенными антителами, направленными против возбудителей инфекций. Это ведет к быстрому выведению специфических антител из организма человека (период полувыведения гетерологичного иммуноглобулина составляет около 14 дней) и снижению эффективности лечения.
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
105
Гетерологичные специфические сыворотки и иммуноглобулины для профилактики и лечения инфекционных болезней (продолжение)
На 7–10 день после введения гетерологичных препаратов в 15–20% случаев развивается сывороточная болезнь. Особенно опасно вводить гетерологичные препараты лицам, ранее получавшим их, что может привести к развитию анафилактического шока.
Одной из важнейших задач совершенствования сывороточных препаратов является замена гетерологичных препаратов на гомологичные с целью полного отказа от применения гетерологичных препаратов.
В РФ выпускается около десяти гетерологичных препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний.
Все препараты выпускаются в жидком виде, в качестве консерванта содержат хлороформ (0,5%), имеют срок годности 2 года (у противостолбнячной сыворотки — 3 года).
Гетерологичные специфические сыворотки и иммуноглобулины для профилактики и лечения инфекционных болезней (ассортимент)
Сыворотка противодифтерийная лошадиная очищенная концентрированная жидкая.
Сыворотки противоботулинические типов А, В, Е очищенные концентрированные лошадиные.
Сыворотка противостолбнячная лошадиная очищенная.
Сыворотка противогангренозная лошадиная очищенная концентрированная.
Иммуноглобулин против клещевого энцефалита (из лошадиной сыворотки).
Иммуноглобулин против японского энцефалита (из лошадиной сыворотки).
Иммуноглобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий.
Иммуноглобулин противолептоспирозный из сыворотки крови волов.
Лактоглобулин противоколипротейный коровий для перорального применения сухой.
Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл коровий для перорального применения сухой.
Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади жидкий.
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
106
Гетерологичные сывороточные препараты для профилактики и лечения неинфекционных заболеваний (продолжение)
Сыворотка против яда гадюки обыкновенной лошадиная очищенная концентрированная жидкая.
1 мл сыворотки содержит не менее 50 антитоксических единиц активности. Применяется для лечения людей, укушенных гадюкой.
Тимоглобулин, кроличий иммуноглобулин к тимоцитам человека (пр-во Франция, зарегистрирован в РФ).
Препарат обладает иммуносупрессивной активностью за счет подавления системы Т-лимфоцитов. Применяется для профилактики отторжения пересаженных органов и лечения апластической анемии, синдрома «трансплантат против хозяина».
Литература
Медуницын Н.В. Вакцинология. — М.: Триада-Х, 2004. — 448 с.
Сассон Альберт. Биотехнология: свершения и на-
дежды. — М.: Мир, 1987. — 411 с.
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
Для заметок
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
107
Тема 1 1 .
Биотехнология при решении проблем экологии и ликвидации антропогенных воздействий на окружающую среду
Цель:
познакомить с проблемами практического применения специфических биотехнологических методов для решения задач охраны окружающей среды.
Рассматриваемые вопросы:
Аэробные и анаэробные процессы переработки отходов.
Методы биологической переработки промышленных отходов.
Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданных методом генной инженерии.
Экологическая биотехнология — специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких как, переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений.
Биологическая переработка отходов опирается на целый ряд дисциплин: биохимию, генетику, химию, микробиологию, химическую технологию и вычислительную технику.
Усилия всех этих дисциплин концентрируются на трех основных направлениях:
1)деградация органических и неорганических токсичных отходов;
2)возобновление ресурсов для возврата в круговорот веществ углерода, азота, фосфора и серы;
3)получение ценных видов органического топлива.
В наиболее широко распространенных установках для очистки сточных вод выполняются четыре основные операции.
1.При первичной обработке удаляются твердые частицы, которые либо отбрасываются, либо направляются в реактор.
2.На втором этапе происходит разрушение растворенных органических веществ при участии природных аэробных микроорганизмов. Образующийся ил, состоящий главным образом из микробных клеток, либо удаляется, либо перекачивается в реактор. По технологии, использующей активный ил, часть его возвращается в аэрационный тенк.
3.На третьем этапе (необязательном) производится химическоеосаждениеиразделениефосфораиазота.
4.Для переработки ила, образующегося на первом и втором этапах, обычно используется процесс анаэробного разложения. При этом уменьшается объем осадка и количество патогенов, устраняется запах, а кроме того, образуется ценное органическое топливо — метан.
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
108
Аэробная переработка отходов
Аэробная переработка стоков включает следующие стадии:
1)адсорбцию субстрата на клеточной поверхности;
2)расщепление адсорбированного субстрата внеклеточными ферментами;
3)поглощение растворенных веществ клетками;
4)рост и эндогенное дыхание;
5)высвобождение экскретируемых продуктов;
6)«выедание» первичной популяции организмов вторичными потребителями.
Эффективность переработки пропорциональна количеству биомассы и времени контактирования ее с отходами.
|
Аэробные процессы биохимической |
|
||||
|
|
очистки сточных вод |
|
|||
экстенсивные |
|
|
интенсивные |
|
||
методы, непосредственно не |
деятельность активного ила |
|||||
связанные |
с |
управляемым |
или биопленки, т. е. естест- |
|||
культивированием микроор- |
венно возникшего биоцено- |
|||||
ганизмов — это поля оро- |
за, |
формирующегося |
на |
|||
шения, поля фильтрации, |
каждом |
конкретном произ- |
||||
биопруды. |
|
|
водстве |
в зависимости |
от |
|
|
|
|
состава сточных вод и вы- |
|||
|
|
|
бранного режима очистки. |
|
||
Активный ил — темно-коричневые хлопья, размером до нескольких сотен микрометров;
состоит на 70 % из живых организмов и около 30 % составляют твердые частицы неорганической природы.
Живые организмы вместе с твердым носителем, к которому они прикреплены, образуют Zoogloea — симбиоз популяций организмов, покрытый общей слизистой оболочкой. Взаимодействие микроорганизмов в пределах одного Zoogloea достаточно сложно и основой его служат симбиотические взаимосвязи организмов разных популяций.
Микроорганизмы, выделенные из активного ила, относятся к различным родам: Actinomyces, Arthro-
bacter, Bacillus, Bacterium, Corynobacterium, Desulfotomaculum, Micococcus, Pseudomonas, Sarcina и
др.
Бактерии рода Pseudomonas окисляют спирты, жирные кислоты, парафины, ароматические углеводороды, углеводы и другие соединения.
Бактерии рода Bacterium (выделено более 30 видов) осуществляют деградацию нефти, парафинов, нафтенов, фенолов, альдегидов и жирных кислот.
Бактерии рода Васillus окисляют алифатические углеводороды.
Окислительная способность перечисленных микроорганизмов для различных органических соединений различна, и лишь для бактерии рода Pseudomonas она практически одинакова для разных видов загрязнений.
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
_______________________________
109
Существенная роль в создании и функционировании консорциума клеток принадлежит простейшим.
Функции простейших достаточно многообразны; они не принимают непосредственного участия в потреблении органических веществ, но регулируют видовой и возрастной состав микроорганизмов в активном иле, поддерживая его на оптимальном уровне.
Поглощая большое количество бактерий, простейшие способствуют выходу значительного количества бактериальных экзоферментов, которые могут концентрироваться в слизистой оболочке и принимать участие в деструкции загрязнений.
Аэротенк — сооружение для биологической очистки сточных вод. Представляет собой систему проточных резервуаров с активной аэрацией.
В аэротенке происходит интенсивное окислениеорганическихвеществмикроорганизмамиактивногоила.
Схема аэротенков
Рис. Схемы аэротенков:
а — вытеснения; б — смешания; в — с рассредоточенной подачей сточной воды и с регенератором активного ила
(Быков В.А. и др. Биотехнология: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препа-
ратов. — М.: Высш. шк, 1987. — 143 с.)
Анаэробные процессы переработки отходов
Применяются, как правило, для сбраживания высококонцентрированных стоков и осадков, содержащих большое количество органических веществ.
Процессы брожения осуществляются в специальных аппаратах, т. е. метантенках.
Процесс брожения состоит из двух стадий: кислой и метановой.
Каждая стадия осуществляется определенной группой микроорганизмов: кислая — органотрофами, метановая — литотрофами. Обе эти группы присутствуют в метантенке одновременно, поэтому кислото- и газообразование протекают параллельно.
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
110