2.Полимеразная цепная реакция (пцр).

Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Необходимо подчеркнуть, что обязательным условием проведения полимеразной цепной реакции является знание нуклеотидной последовательности того или иного объекта исследования (вирус, бактерия и др.). В настоящее время в банках данных имеются практически полные сведения о геноме различных патогенных микробов.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К.Мюллисом . В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности, который является маркерным для данного вида возбудителя. In vivo ПЦР включает несколько стадий:

1. Денатурация ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.

3. Синтез новой цепи ДНК.

При многократном повторении циклов репликации происходит увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволяет из единичных клеток микроорганизмов, содержащихся в анализируемом биологическом материале, получить необходимое количество ДНК для их идентификации.

Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3'концы этих синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу. (Праймер - короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой, комплементарно связанная с однонитевой ДНК или РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начинает наращивать полидезоксирибонуклеотидную цепь.)

Таким образом, полимеразная цепная реакция — это многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка. Полученную смесь прогревают в течение 1 мин при 94 °С, при этом комплементарные нити ДНК разъединяются. Этот этап называют денатурацией ДНК («плавлением»).

Затем температуру снижают до 45 — 65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживают ее 1,0—1,5 мин. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3'концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5'концу. Этот этап называют «отжигом». На третьем этапе поддерживается температура 72 °С. Это оптимальная температура для работы применяемой в ПЦР полимеразы. Данный фермент, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, содержащиеся в смеси, достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3 концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется «элонгация» (удлинение).

Циклическое повторение трех приведенных температурных режимов выполняется с помощью автоматических устройств — термоциклеров (амплификаторов).

Как правило, проводится 30 циклов, что теоретически позволяет получить 230 копий участка ДНК возбудителя.

ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

3.У беременной женщины РСК с токсплазменным антигеном отрицательна, ВКП с токсоплазмином + + + +. Как оценить реакции? Что рекомендовать женщине?

Серологическое окно- период когда реакции отрицательны. Взять повторно анализы через неделю.