5. Эмиссионный анализ: флюориметрия
И ПЛАМЕННАЯ ФОТОМЕТРИЯ. АТОМНО-ЭМИССИОННЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
В клинической химии в последние годы наряду с методами абсорбционного молекулярного спектрального анализа все более широко применяются методы эмиссионного анализа (эмиссия — излучение), основанные на способности многих органических веществ (фенолов, ароматических аминов, полициклических соединений, сопряженных полиаминов и др.) люминесцировать, т. е. давать характерный спектр испускания при освещении исследуемого образца ультрафиолетовым или другим коротковолновым излучением (флюориметрия), а также ряда простых веществ (металлов: макро- и микроэлементов) испускать свет при помещении анализируемого образца в источник высокой температуры (пламенная фотометрия, атомно-эмиссионный спектральный анализ).
Приборы, использующиеся для измерения концентрации вещества по интенсивности его флюоресценции (т. е. вторичного излучения, возникающего в ответ на облучение анализируемого вещества светом с более короткой длиной волны), именуются флюориметрами. В отличие от фотоэлектроколориметров в них всегда используется источник ультрафиолетового света, монохромати-зация световых потоков (возбуждение и испускание) достигается применением интерференционных светофильтров или монохроматоров. Исследуемый раствор вносится в кварцевую кювету, приемник излучения (фотоумножитель, ФЭУ) располагается под прямым углом к возбуждающему флюоресценцию монохроматическому световому потоку, а возбуждаемый в ФЭУ сигнал подается либо непосредственно на чувствительный гальванометр, либо после предварительного усиления — на стрелочный или цифровой прибор, печатающее устройство.
Методы этой группы характеризуются исключительно высокими чувствительностью и избирательностью благодаря применению процедуры предварительного отделения анализируемого продукта от других веществ, обладающих близкой химической структурой; преобразованию его в соединение, отличающееся более высоким квантовым выходом (что осуществляется, например, в тригидроксииндоловом методе определения катехола-минов); использованию такой узкой области ультрафиолетового (монохроматического) света, в которой возбуждается флюоресценция лишь интересующего исследователя метаболита; а также благодаря существенным различиям в максимумах спектров возбуждения и флюоресценции продуктов с несколько разной химической структурой и весьма малой вероятности того, что в содержимом кюветы флюориметра имеются два или более вещества, способных излучать в выбранном режиме возбуждения флюоресценции. Применение же для регистрации свечения ФЭУ и усилителей «снимаемого» сигнала придает методам флюоресцентного анализа весьма большую чувствительность.
К настоящему времени завершены государственные испытания первого отечественного универсального высо-
кочувствительного флкюриметра для клинической лабораторной диагностики. Этот прибор («ФЛЮОТЕСТ») позволит осуществлять все виды клинико-биохимических исследований методами ультра- и субмикроанализа, в том числе и те, которые не могут быть выполнены с применением абсорбционной фотометрии. Он заключает в себе набор светофильтров, позволяющий производить исследования биологически активных веществ (катехоламинов, гис-тамина и др.), гормонов (11 оксикортикостероидов), витаминов (группы В, Е и др.), атерогенных липопротеинов (при использовании флюоресцентного зонда), порфиринов, ферментов (активности аспартатаминотрансферазы, алани-наминотрансферазы и др.), субстратов и т. д.
Пламенная фотометрия — вид исследования, используемый для определения содержания электролитов и некоторых других элементов, атомы которых способны возбуждаться и испускать свечение в высокотемпературном пламени газовой горелки. Принцип определения состоит в следующем. Растворенный в воде образец (биологический материал) вводят в пламя посредством распылителя. В случае достаточно высокой температуры пламени внешние электроны атома, получая часть тепловой энергии, переходят на более высокие энергетические уровни. В возбужденном состоянии атомы способны пребывать весьма непродолжительное время. При возвращении возбужденных электронов на исходный стационарный уровень поглощенная ими энергия выделяется в виде световых квантов. Длина волны испускаемого света, зависящая от структуры электронной оболочки атома, отражает химическую природу элемента.
Если свет пламени, в котором находятся атомы металлов, разложить с помощью призмы в спектр, то он окажется линейчатым (спектр испускания). По интенсивности свечения его основной, так называемой характеристической, линии, выделяемой с помощью интерференционного светофильтра, можно судить о количественном содержании элемента в исследуемой биологической жидкости.
Основными ограничениями в исследовании спектра элементов являются: сравнительно низкая температура пламени (недостаточная для возбуждения свечения атомов множества элементов) и безызлучательные переходы. Для достижения высокой температуры пламени используют различные горючие газы: бутан или пропан, — хотя лучший тепловой эффект отмечается при использовании ацетилена или водорода. В качестве окислителя обычно применяют подаваемый под давлением (компрессором) атмосферный кислород.
Одна из наиболее важных областей применения пламенной фотометрии — одновременное определение натрия и калия (а иногда и кальция, лития). Эти элементы возбуждаются значительно легче остальных, и характеристические линии их спектра излучения четко отделены друг от друга. При применении более «горячего» пламени и чувствительных регистрирующих устройств становится возможным анализировать до 50 элементов.
Интенсивность излучения на длине волны, характерной для определяемого элемента, практически пропорциональна концентрации соответствующих катионов.
Пламенная фотометрия осуществляется с применением специального прибора, именуемого пламенным фотометром.