Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Розділ 4. Фізіологія бактерій

61

Посів шпателем і тампоном у чашки Петрі. Матеріал попередньо нано-

сятьнаповерхнюживильногосередовищабілякраючашкипетлеюабопіпеткою. Стерильний шпатель проносять через полум’я, охолоджують, торкаючись стінки чашки. Обережними круговими рухами, тримаючи чашку напівзакритою, розподіляють матеріал рівномірно по поверхні середовища.

При посіві тампономчашку дещо відкривають однією рукою, тампономторкаються поверхні агару біля краю чашки і починають проводити посів штрихами від краю до краю чашки, втираючи обережно матеріал у поверхню середовища, не пошкоджуючи його, поступово обертаючи тампон. Після проведення посіву чашку обертають на 90° і повторюють посів перпендикулярно до попереднього.

При посіві уколом у стовпчик живильного середовища пробірку з м’ясо-

пептонним агаром, желатином тощо беруть у ліву руку, петлю з матеріалом – у праву і роблять укол до дна пробірки в середовище. Петлю обережно виймають, а пробірку закривають.

Посів матеріалу в товщу живильного середовища. Перед посівом матері-

ал повинен бути в рідкому стані. Стерильною градуйованою піпеткою набирають 0,1, 0,5 або 1,0 мл матеріалу і виливають його в стерильні чашки Петрі. Після цьогоматеріалзаливають15-20 млрозтопленогойохолодженогодо45-50°СМПА. Обережнопохитуючичашку, круговимирухамипоповерхністолаперемішуютьв ній матеріал, досягаючи його рівномірного розподілу в середовищі. Чашку залишають закритою до повного застигання агару, а потім перевертають догори дном.

Для того, щоб виділити чисту культуру мікроорганізмів, слід відділити численні бактерії, які знаходяться в матеріалі, одна від одної. Це можна досягнути за допомогою методів, які засновані на двох принципах – механічному ібіологічному роз’єднанні бактерій.

Методи виділення чистих культур, засновані на механічному принципі

Метод послідовних розведень, запропонований Л. Пастером, був одним із найперших, який застосовувався для механічного роз’єднання мікроорганізмів. Вінполягаєвпроведенніпослідовнихсерійнихрозведеньматеріалу, якиймістить мікроби, в стерильному рідкому живильному середовищі. Цей прийом достатньо кропіткий і недосконалий у роботі, оскільки не дозволяє контролювати кількість мікробних клітин, які попадають у пробірки при розведеннях.

ЦьогонедолікунемаєметодКоха(методпластинчастихрозведень). Р. Кох використовував щільні живильні середовища на основі желатину або агар-агару. Матеріал з асоціаціями різних видів бактерій розводився у декількох пробірках з розтопленим і дещо охолодженим желатином, вміст яких пізніше виливався на стерильніскляніпластини. Післязастиганнясередовищавонокультивувалосьпри оптимальній температурі. У йоготовщі утворювалисьізольованіколоніїмікроорганізмів, які легко можуть бути перенесені на свіже живильне середовище за допомогою платинової петлі для одержання чистої культури бактерій.

Метод Дригальського є більш досконалим методом, який широко розповсюдженийвповсякденніймікробіологічнійпрактиці. Спочаткунаповерхнюсере-

62	Частина І. Загальна мікробіологія

довища в чашці Петрі піпеткою або петлею наносять досліджуваний матеріал. За допомогоюметалевогоабоскляногошпателяйогоретельновтирають усередовище. Чашку під час посіву тримають привідкритою і обережно обертають, щоб рівномірно розподілитиматеріал. Не стерилізуючи шпателя, проводять ним посів матеріалу в іншій чашці Петрі, при потребі– втретій. Тільки після цьогошпатель занурюють у дезінфікуючий розчин або прожарюють у полум’ї пальника. На поверхнісередовищавпершійчашціспостерігаємо, якправило, суцільнийрістбактерій, удругій– густийріст, автретій– рістувиглядіізольованихколоній(рис. 20).

Методштриховихпосівівсьогоднівикористовуєтьсявмікробіологічнихлабораторіях найчастіше. Матеріал, який містить мікроорганізми, набирають бактеріологічною петлею і наносять на поверхню живильного середовища біля краю чашки. Знімаютьнадлишокматеріалуіпроводятьпосівйогопаралельнимиштрихами від краю до краю чашки. Через добу інкубації посівів при оптимальній температурі на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікробів (рис. 21).

Рис. 20. Ріст бактерій в чашках Петрі при посіві	Рис. 21. Ізольовані
за методом Дригальського.	колонії бактерій при
	посіві штрихом.

Дляодержанняізольованихколонійможнавикористатипосівтампоном, яким проводили забір досліджуваного матеріалу. Дещо привідкривають чашку Петрі із живильним середовищем, вносять туди тампон і обережними рухами втирають матеріал у поверхню чашки, повертаючи поступово тампон і чашку.

Таким чином, істотна перевага методів пластинчастих розведень Коха, Дригальського і штрихових посівів полягає в тому, що вони створюють ізольовані колонії мікроорганізмів, які при інокуляції на інше живильне середовище перетворюються в чисту культуру

Методи виділення чистих культур, засновані на біологічному принципі

Біологічний принцип роз’єднання бактерій передбачає цілеспрямований пошук методів, які враховують численні особливості мікробних клітин. Серед найпоширеніших методів можна виділити наступні:

1. За типом дихання. Всі мікроорганізми за типом дихання поділяються на дві основні групи: аеробні (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae тощо) та анаеробні(Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens таін.).

Якщо матеріал, з якого слід виділити анаеробні збудники, попередньо прогріти, а потім культивувати в анаеробних умовах, то виростуть саме ці бактерії.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

63

2. Заспороутворенням. Відомо, щодеякімікроби(бацилиіклостридії) здатні доспороутворення. СереднихClostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Спори стійкі до дії факторів зовніш-

нього середовища. Отже, досліджуваний матеріал може бути підданий дії термічного фактора, а потім інокулятивно перенесений в живильне середовище. Через деякий час на ньому виростуть саме ті бактерії, які здатні до спороутворення.

3. Стійкість мікробів до дії кислот і лугів. Деякі мікроби (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) внаслідокособливостейїххімічноїбудовистійкі до дії кислот. Ось чому матеріал, який їх містить, наприклад, харкотиння при туберкульозі попередньо обробляють рівним об’ємом 10 % розчину сірчаної кислоти, а потім висівають на живильні середовища. Стороння флора гине, а мікобактерії внаслідок їх резистентності до кислот, виростають.

Холерний вібріон (Vibrio сholerae), навпаки, є галофільною бактерією, тому длястворенняоптимальнихумовростуйоговисіваютьнасередовища, якімістять луг (1 % лужна пептонна вода). Вже через 4-6 год на поверхні середовища з’являються характерні ознаки росту у вигляді ніжної голубуватої плівки.

4.Рухомість бактерій. Деякі мікроби (Proteus vulgaris) маютьтенденцію до повзучого росту і здатні швидко розповсюджуватись по поверхні дещо вологого середовища. Для виділення таких збудників їх засівають у краплинку конденсаційноїрідини, якаутворюєтьсяприохолодженністовпчикаскошеногоагару. Через 16-18 год вони розповсюджуються на всю поверхню середовища. Якщо взяти матеріал з верхньої частини агару, будемо мати чисту культуру збудників.

5.Чутливість мікробів до дії хімічних речовин, антибіотиків та інших протимікробних засобів. Внаслідок особливостей метаболізму бактерій вони можуьмати різну чутливістьдодеякиххімічнихчинників. Відомо, щостафілококи, аеробні бацили, що утворюють спори, стійкі до дії 7,5–10 % хлориду натрію. Ось чому для виділення цих збудників використовують елективні живильні сере-

довища (жовтково-сольовий агар, маніт-сольовий агар), які містятьсаме цюречовину. Інші бактерії при такій концентрації хлориду натрію практично не ростуть.

6. Введення деяких антибіотиків (ністатин) використовується для гальмування росту грибів у матеріалі, який сильно контамінований ними. І, навпаки, додавання антибіотика пеніциліну до середовища сприяє інгібуванню росту бактеріальної флори, якщо треба виділити гриби. Додавання фуразолідону в певних концентраціях до живильного середовища створює селективні умови для росту коринебактерій і мікрококів.

7. Здатність мікроорганізмів проникати через неушкоджені шкірні по-

криви. Деякі патогенні бактерії (Yersinia pestis) внаслідок наявності великої кількостіферментівагресіїздатніпроникатичерезнепошкодженушкіру. Дляцього шерсть на тілі лабораторної тварини голять і в цю ділянку втирають досліджуваний матеріал, який містить збудника і велику кількість стороньої мікрофлори. За деякийчастваринузабивають, азкровіабовнутрішніхорганіввиділяютьмікроби.

8. Чутливість лабораторних тварин до збудників інфекційних захворю-

вань. Окремі тварини проявляють високу чутливість до різних мікроорганізмів.

64	Частина І. Загальна мікробіологія

Наприклад, при будь-якому способі введенняStreptococcus pneumoniae білим мишам у них розвивається генералізована пневмококова інфекція. Аналогічна картинаспостерігаєтьсяпризараженнігвінейськихсвинокзбудниками туберкульозу

(Mycobacterium tuberculosis).

У повсякденній практиці бактеріологи користуються такими поняттями як штам і чиста культура мікроорганізмів. Під штамом розуміють мікроби одного виду, які виділено з різних джерел, або з одного й того ж самого джерела, але в різний час. Чиста культура бактерій – це мікроорганізми одного виду, нащадки однієї мікробної клітини, які виросли на (в) живильному середовищі.

Етапи виділення чистих культур мікроорганізмів та їх ідентифікація

Виділення чистої культури аеробних мікроорганізмів складається з ряду етапів.

У перший день (І етап дослідження) у стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) забираютьпатологічний матеріал. Йоговивчаютьзазовнішнімвиглядом, консистенцією, кольором, запахомта іншим ознаками, готуютьмазок, фарбують і досліджують під мікроскопом. У деяких випадках (гостра гонорея, чума) на цьому етапі можна поставити попередній діагноз, а крім того, підібрати середовища, на які засіватиметься матеріал. Посів проводять бактеріологічною петлею (застосовується найчастіше), за допомогою шпателя за методом Дригальського, ватномарлевим тампоном. Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37 °С) на 18-48 год. Мета етапу – одержати ізольовані колонії мікроорганізмів.

Однак, деколи з метою нагромадження матеріалу його засівають на рідкі живильні середовища.

Надругийдень(ІІетапдослідження) наповерхніщільногоживильногосередовища мікроорганізми утворюють суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія– цевидимінеозброєнимокомскупченнябактерійнаповерхніабовтовщі живильногосередовища. Якправило, кожнаколоніяформуєтьсязнащадківоднієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Особливості росту бактерій на живильних середовищах є проявом їх культуральних властивостей.

Чашки ретельно розглядають і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. При потребі досліджують колонії під лупою, малим чи великим збільшенням мікроскопа. Структуру колоній досліджуютьупрохідномусвітліпрималомузбільшеннімікроскопа. Вониможутьбути гіалінові, зернисті, ниткоподібні чи волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній.

Характеристика колоній – важлива складова частина роботи бактеріолога і лаборанта, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії

(рис. 22).

Характеризувати колонії можна за різними ознаками. За величиною (діаметром) їх поділяють на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1-2 мм),

Рис. 22. Види колоній

мікроорганізмів.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

65

карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна(амебоподібна), ризоїдна. Вонибуваютьпрозорими, що пропускають світло, і мутними.

За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі, щостеляться поповерхні середовища, ізвдавленимцентром, зприпіднятоюувиглядісоскасерединою.

Поверхня колоній може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth – гладенький), а шорсткі – R-форми (rough – шорсткий, нерівний).

Формашорсткихповерхоньтакожможебутирізноманітною: зморшкуватою, гірозною, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.

Переважнабільшістьмікроорганізмівутворюєбез- барвніколоніїабомутно-молочногокольору. Однакдеякі з них формують кольорові колонії. Їх колір визна-

чається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

З підозрілих колоній готують мазки, забарвлюють за методом Грама для вивченняморфологічнихтатинкторіальнихвластивостейзбудників, досліджуютьрухомість бактерій у “висячій” чи “надавленій” краплі. Ці ознаки мають надзвичайно велике діагностичне значення при характеристиці окремих видів мікроорганізмів.

Рештки досліджуваних колоній обережно, не торкаючись інших, знімають із поверхні середовища і засівають на скошений агар або на сектори чашки Петрі із живильним середовищем для одержання чистої культури. Пробірки або чашки з посівами поміщають у термостат при оптимальній температурі на 18-24 год.

Сьогодні, як правило, бактеріологи намагаються користуватись стандартними сухими живильними середовищами, які випускає мікробіологічна промисловість. Такі середовища дозволяютьсуттєво покращити результати мікробіологічних досліджень і стандартизувати їх.

На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних.

Бактеріїздатнівикликатидифузнепомутніннясередовища, колірйогоприцьому моженезмінюватисьабонабуває кольору пігменту. Такий характерросту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів.

Деколивідбуваєтьсяутворенняосадунадніпробірки. Вінможебутикрихтоподібним, гомогенним, в’язким, слизистим таін. Середовище над нимможе зали-

66	Частина І. Загальна мікробіологія

шатисьпрозоримабоставатимутним. Якщомікробипігментунеутворюють, осад має сірувато-білий або жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії.

Пристінковийрістпроявляєтьсяутвореннямпластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим.

Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в’язку, слизисту консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами.

У разі потреби виготовляється мазок, забарвлюється, досліджується під мікроскопом, а мікроорганізми засіваються петлею на поверхню щільного живильного середовища для одержання ізольованих колоній.

На третій день(ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію.

Спочатку звертають увагу на особливості росту мікроорганізмів на середовищі та роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста. У деяких випадках вже за зовнішнім виглядом та особливостями їх росту можна зробити висновок про вид виділених збудників. Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією. Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією.

Однак цих досліджень недостатньо, щоб зробити остаточний висновок про вид виділених мікробів. Тому вивчають біохімічні властивості бактерій. Вони доситьрізноманітні. Найчастішедосліджуютьцукролітичні, протеолітичні, пептолітичні, гемолітичні властивості, утворення ферментів декарбоксилаз, оксидази, каталази, плазмокоагулази, ДНК-ази, фібринолізину, перетвореннянітратівунітрититощо. Дляцьогоіснуютьспеціальніживильнісередовища, якізасіваютьмікроорганізмами (строкатий ряд Гісса, МПБ, згорнута сироватка, молоко та ін.). Визначення виду збудника за йогобіохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.

Длядослідженняздатностібактерійрозщеплюватибілки(протеолітичнівластивості) використовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у молоцівиражаєтьсярозчиненнямзгусткаказеїну, якийутворенобактеріями, щозгортають молоко.

Середовища із желатином готують на м’ясній воді, додаючи 1 % пептону, 0,5 % хлориду натрію та 10-20 % желатину. Посівроблять уколом. Протеоліз проявляється розрідженням стовпчика середовища. Оскільки деякі види бактерій відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю ознаку можна враховувати при їх ідентифікації.

Розділ 4. Фізіологія бактерій

67

Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони – продукти неповного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засіваютьмікроорганізмами, апотімвизначаютьутвореннякінцевихпродуктів– аміаку, сірководню та індолу. Для знаходження аміаку в пробірку вставляють та притискаютьпробкоючервонийлакмусовийпапірець. Ватмосферіаміакувіннабуває синього забарвлення. Індикатором на сірководень є розчин ацетату свинцю, який за аналогічних умоввизначення забарвлюєфільтрувальний папір, змочений індикатором, у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю.

Індол можна виявити за допомогою смужки фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти. За наявністю індолу папірець набуває рожевого кольору. Більш чутливим є метод Ерліха. Згідно із загальноприйнятим методомпробкоюпробіркипритискаютьпапірець, просякнутийспеціальниміндикатором(спиртовийрозчинпарадиметиламідобензальдегіду). Принаявностііндолу колірйогозмінюєтьсянабузково-рожевийабомалиновий. Віншомуваріанті виз- наченняіндолудо48-годинноїбульйонноїкультурибактерійдодають1-2 млсірчаного ефіру, а потім – реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв з’являється яскраве малинове кільце.

У мікробіологічній практиці широко використовуються диференційно-діаг- ностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозволяють виявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією. Ці середовища є елективними для багатьох представників родини кишкових бактерій. Випускаються вони у сухому вигляді, тому їх приготування в лабораторіях не потребує багато часу.

Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчиномсульфіту натрію. Свіжесередовище має слабке рожеве забарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-черво- ний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на цьому середовищі безбарвні.

До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарвлення, а лактозонегативні – рожевий відтінок.

Сухий бактоагар Плоскирєва (Бактоагар Ж) містить у складі агар із солями жовчних кислот лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми, щорозщеплюютьлактозу, утворюютьколонії рожевогокольору, аті, щоїїнеферментують – безбарвні.

У мікробіологічній практиці часто виникає потреба дослідити ферментацію не тільки одного, а декількох цукрів відразу. З цією метою використовують середовища Гісса. Вони можуть мати рідку та напіврідку консистенцію.

Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До нього

68	Частина І. Загальна мікробіологія

додають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). Встановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглеводами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилізують парою під тиском 0,5 атм 15 хв.

Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу. Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовишеГісса: мікроорганізминеферментуютьсубстрату(негативнавідповідь) або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу.

Враховуючи, що мікроорганізми по-різному діють на вуглеводи (розкладають або не розкладають), при кінцевому обліку результатів спостерігають пробірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса.

Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середовищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви живильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором ВР воно стає синім, а при підлужнюванні – червоним (бромкрезоловий пурпурний приутвореннікислотидаєдещофіолетоветалимонно-жовтезабарвлення, абромтимоловий синій – зеленкувате або лимонне). У лужному середовищі вонимають відповідно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.

ВипускаютьсятакожсухісередовищаРесселатацукровийагарізсечовиною Олькеницького.

СередовищеРесселаєнапіврідкимагаромізлактозою(1 %) іглюкозою(0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спостерігають за появою його бульбашок або розривами агару.

Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького – більш складне середовище порівняно з попереднім. Він дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози, глюкози, утвореннясірководнютанаявністьубактерійферменту уреази. Доскладу середовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сільамоній-залізосульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір.

При розщепленні цукрів феноловий червоний забарвлює середовище в жовтий колір. Оскільки глюкоза наявна в невеликих концентраціях (0,1 %), в аероб-

Розділ 4. Фізіологія бактерій

69

них умовах (скошена поверхня) бактерії повністю утилізують її за перші години росту. Через 18-24 год вони споживають і пептони як білкову живильну основу. При цьому утворюється аміак, який робить середовище лужним, надаючи йому червоного кольору. Однак у стовпчику агару жовтий колір залишається, тому що там зберігаються кислі кінцеві продукти, які забезпечують низький рівень рН.

Ентеробактерії, які розкладають лактозу й глюкозу, підкислюють середовище в усій пробірці (жовтий колір стовпчика та скошеної поверхні). Оскільки лактози (1 %) в 10 разів більше, ніж глюкози, через 18-24 год інкубації її запаси ще невичерпані, тому зберігається жовтий колір середовища. Однак через 48 год за рахунок розщеплення пептонів можна спостерігати за його почервонінням (зсув рН у лужну сторону).

Якщо бактерії утворюють газ (вуглекислий, водень) при ферментації цукрів, з’являються розриви середовища або відбувається скупчення газу на дні, що піднімає агар у пробірці.

Сірководеньмікробиутворюютьзнеорганічнихсполук, завдячуючиферменту тіосульфатредуктазі. Взаємодіютьізсірководнемсолізаліза, які, вступаючизним у реакцію, утворюютьсульфідзалізаувиглядінерозчинногопреципітатучорного кольору в стовпчику.

Уреаза, яку продукують бактерії, руйнує сечовину з виділенням великої кількості аміаку, під впливом якого все середовище червоніє. Тому при наявності уреазопозитивнихштамівпровестиоблікферментаціїцукрівнеможливо. Втаких випадках необхідно використовувати інші середовища.

За останні роки в практиці мікробіологічних лабораторій почали використовувати спеціальні тест-системи для визначення різноманітних властивостей бактерій: “Roche”, “API”, “Enterotest”, пластинитадискиіндикаторнібіохімічні. Вони зручні для користування, надійні, дозволяють визначати 12-20 і більше різноманітних ознак, значно полегшити ідентифікацію мікробів (див. вкл., рис. 7).

Гемолітична активність мікроорганізмів є однією з найсуттєвіших ознак їх вірулентності, томуїївизначеннясталорутинноюпроцедуроюбудь-якоїспеціалі- зованої лабораторії. З цією метою використовують кров’яний МПА. Його готуютьзрозтопленоготаохолодженого до 45-50 °Сживильного агару, доякого додають 5-10 % дефібринованої або свіжої крові тварини (барана або кролика). Агар з кров’ю ретельно перемішують, не допускаючи утворення піни, і розливають у чашкиПетрі. Якщобактеріїпродукуютьгемолізини, навколоколонійабоштрихів посіву утворюються зони просвітління на матовому червоному фоні (див. вкл., рис. 8). За кольором гемолізу (безбарвний, зеленкуватий) можна визначити тип гемолізинів (α , β , γ тощо).

Щоб виявити ліполітичні властивості мікробів, до складу живильних середовищ вводять ліпіди або жироподібні субстанції – твіни. Бактерії за таких умов утворюють райдужні вінчики навколо колоній при розщепленні ліпідів.

Редукуючі властивості вивчають, додаючи до складу середовищ барвники (метиленовий синій, наприклад), які здатні відновлюватись. Фіксуючи час зміни кольоруіндикатора, можнасудитипроступіньвираженняредукуючоїактивності.

70	Частина І. Загальна мікробіологія

Декарбоксилазнуактивністьбактерійоцінюютьнаспеціальнихсередовищах з амінокислотами (лізином, орнітином, глютаміновою кислотою та ін.) і відповідними індикаторами.

З метою встановлення видової належності бактерій часто вивчають їх антигенну будову, тобто проводять ідентифікацію за антигенними властивостями. Кожний мікроорганізм має у своєму складі різні антигенні субстанції. Зокрема, представникиродиниентеробактерій(ешеріхії, сальмонели, шигели) містятьоболонковий О-антиген, джгутиковий Н-антиген і капсульний К-антиген. Вони неодноріднізасвоїмхімічнимскладом, томуіснуютьубагатьохваріантах. Їхможна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення виду бактерій носить назву серологічної ідентифікації. Його відносять до одногозголовнихметодів встановлення видувиділеної культури. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), апотімукожнукраплювносятьстерильноюпетлеюневеликукількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації. Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудниката антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера).

Придеякихінфекційнихзахворюваннях(дифтерія) ідентифікаціюпроводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію.

Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти– найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів.

Дуже важливимпривиділеннімікроорганізмівєвизначенняїхчутливостідо антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузій- ний метод). Для цьогонаповерхнюспеціального щільногоживильного середовищавчашкахПетрізасіваютькультурумікроорганізмівінакладаютьпаперовідиски, просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів.

На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збуд-

ник належить до виду Staphylococcus epidermidis”.