9.3.4. Окислительное фосфорилирование

С процессом переноса электронов электронтранспортной цепью митохондрий тесно сопряжён синтез АТФ. При изучении работы систем синтеза АТФ с участием изолированных митохондрий выяснено, что способностью к образованию АТФ обладают только неповреждённые митохондрии. В исследованиях Белицера В.А. и Калькара Г. (1937 г.) было показано, что в процессе синтеза АТФ происходит потребление неорганического фосфата и АТФ. В дальнейшем Очоа С. (1941 г.) установил количественный выход АТФ в расчёте на один атом кислорода, использованного в процессе дыхания, при окислении различных субстратов и экспериментально доказал, что в результате переноса двух электронов по всей электронтранспортной цепи митохондрий отношение числа синтезированных молекул АТФ к числу потреблённых атомов кислорода равно 3:1.

Затем в 1949-1955 г.г. с использованием искусственных акцепторов электронов были выяснены участки электронтранспортной цепи, на которых при переносе электронов обеспечивается запас свободной энергии, необходимый для синтеза АТФ. Таких участков оказалось три. Один из них включает ферментный комплекс I, осуществляющий перенос электронов от НАДН на окисленный убихинон и сопутствующий перенос протонов из внутреннего матрикса на внешнюю поверхность внутренней мембраны митохондрий. Второй участок, создающий потенциал для синтеза АТФ, – это ферментный комплекс III. Третий участок представляет собой ферментный комплекс IV. На каждом из этих участков происходит трансмембранный перенос протонов, создающий определённой величины трансмембранный электрохимический потенциал, обладающий значительным запасом свободной энергии. При переносе электронов от ФАДН₂ с участием убихинона на ферментный комплекс III трансмембранного переноса протонов не наблюдается, поэтому на этом участке не создаётся запас свободной энергии для синтеза АТФ.

Исходя из полученных экспериментальных данных, было определено, что при окислении каждой молекулы НАДН на трёх участках электронтранспортной цепи создаётся запас свободной энергии, достаточный для синтеза АТФ, при реализации которого в результате переноса пары электронов на кислород и сопутствующего переноса через мембрану митохондрии шести протонов поисходит образование трёх молекул АТФ. При окислении же каждой молекулы ФАДН₂ только на двух участках электронтранспортной цепи создаётся потенциал для синтеза АТФ, поэтому в результате переноса электронов от ФАДН₂ на кислород в расчёте на каждую переносимую пару электронов осуществляется перенос через мембрану четырёх протонов и в конечном итоге образование двух молекул АТФ.

Учитывая, что разность стандартных окислительно-восстановитель-ных потенциалов НАДН и кислорода составляет 0,82-(-0,32)= 1,14В, можно рассчитать изменение свободной энергии при окислении 1 моля НАДН кислородом. Оно рассчитывается по формуле Gºˈ= –nFEºˈ= –296,41,14 = –219,8 кДж. На синтез же трёх молей АТФ затрачивается 30,63= 91,8 кДж энергии. Эффективность использования энергии в этом процессе равна ~ 42%. Если по такой же схеме произвести расчёт коэффициента использования энергии в ходе окисления в митохондриях ФАДН₂, то мы получим величину ~36%.

Процесс образования АТФ в митохондриях, сопряжённый с окислением восстановленных динуклеотидов, являющихся продуктами дыхания, получил название окислительного фосфорилирования. Механизм этого процесса в настоящее время наиболее удовлетворительно объясняется хемиосмотической гипотезой, предложенной в 1961 г. английским биохимиком Митчеллом П. Согласно хемиосмотической гипотезе для синтеза АТФ в митохондриях используется энергия трансмембранного электрохимического потенциала, который образуется на внутренней мембране митохондрии в результате переноса через неё протонов из внутримитохондриального матрикса ферментными комплексами электронтранспортной цепи митохондрий. Синтез АТФ катализирует АТФ-синтетазный ферментный комплекс (F₁), локализованный на внутренней поверхности митохондриальной мембраны (рис. 37), который по своему строению и выполняемой функции сходен с АТФ-синтетазным комплексом хлоропластных мембран.

АТФ-синтетазный комплекс соединяется на мембране с другим белковым комплексом F₀, который пронизывает внутреннюю митохондриальную мембрану и выполняет роль ионного канала, способного осуществлять транспорт протонов через мембрану с её внешней поверхности во внутренний матрикс по электрохимическому градиенту. При этом установлено, что при прохождении через ионный канал каждой пары протонов под действием АТФ-синтетазы происходит синтез одной молекулы АТФ согласно реакции:

Н₃РО₄ + АДФ  АТФ + Н₂О

Согласно такому механизму действия АТФ-синтетазного комплекса становится понятно, что если при окислении 1 молекулы восстановленного динуклеотида НАДН ферментами электронтраспортной цепи митохондрий осуществляется перенос через мембрану шести протонов, то при обратном их прохождении через ионный канал инициируется синтез трёх молекул АТФ. А если при окислении ФАДН₂ осуществляется трансмембранный перенос только четырех протонов, то и при их прохождении через ионный канал осуществляется синтез двух молекул АТФ. Механизм образования АТФ в активном центре АТФ-синтетазного комплекса окончательно ещё не выяснен.

Согласно химическим принципам образования связей понятно, что протоны, проходящие через ионный канал, направленно воздействуют на один из атомов кислорода, соединенный с фосфором или в неорганическом фосфате, или в АДФ, при этом образуется молекула воды. Неорганический фосфат и АДФ связываются в нужной ориентации группировками активного центра АТФ-синтетазы. В связи с тем, что они являются кислотами и подвергаются диссоциации, к активному центру присоединяются анионы, содержащие электроотрицательные атомы кислорода, на один из которых воздействуют протоны, поступающие из ионного канала. После образования молекулы воды, становится возможным возникновение фосфо-эфирной связи между остатками фосфорной кислоты неорганического фосфата и АДФ с последующим синтезом молекулы АТФ:

протоны из ионного канала

O 2Н⁺ OH О ОН

||  | || |

НО–Р–О^{- -}О–РО–АМФ  НО–РО–РО–АМФ

| | || | | ||

| ОН О Н₂О ОН О

------------------------------ АТФ

анионы неорганического

фосфата и АДФ в активном

центре АТФ-синтетазы

Известны вещества, способные разобщать процессы дыхания и окислительного фосфорилирования. Под воздействием этих веществ активируется транспорт электронов по электронтранспортной цепи митохондрий, но ингибируется синтез АТФ. Разобщающее действие таких веществ заключается в том, что они переносят протоны через мембрану по электрохимическому градиенту, разряжая трансмембранный электрохимический потенциал. К веществам–ингибиторам окислительного фосфорилирования относится 2,4-динитрофенол.

У растений во внутренней мембране митохондрий, кроме основной электронтранспортной цепи, функционирует ещё один механизм передачи электронов на кислород. Он осуществляется с участием так называемой альтернативной оксидазы, способной акцептировать электроны от КоQН₂. Такой перенос электронов не сопряжён с синтезом АТФ, а весь запас свободной энергии, освобождающейся при окислении, превращается в тепло. Функцию альтернативной оксидазы, вероятно, выполняют вещества хиноидной природы. Их активность как оксидаз возрастает при высокой концентрации в клетках АТФ или снижении активности основной дыхательной цепи митохондрий.