Заняття №13

Тема: Гуморальна імунна відповідь. Імуноглобуліни (антитіла): визначення, класи, властивості, практичне використання. Серологічні реакції: реакція аглютинації, реакція преципітації, реакція нейтралізації.

Актуальність теми: Гуморальна Імунна відповідь є однією із головних реакцій на введення (попадання) антигенів в організм людини або тварини. Гуморальну Імунну відповідь визначають для оцінки рівня імуногенності антигенів, а кінцевий результат її - антитіла широко використовують в медичній практиці для діагностики, профілактики та лікування ряда інфекційних захворювань.

Мета (загальна): знати з якою метою в медичній практиці використовуються антитіла, та уміти оцінювати результати реакції аглютинації, реакцію преципітації, реакцію нейтралізації.

Конкретні цілі

Вихідний рівень

Уміти:

1 .Уміти поставити та оцінити реакцію аглютинації на склі та розгорнуту.	1. Готувати різні розведення речовин в рідині та визначити їх титр в рідині ( кафедра хімії)
2. Уміти поставити та визначити титр антитіл в реакції непрямої (пасивної) гемаглютинації(РНГ А).

Теоретичні питання:

1. Гуморальна імунна відповідь: визначення, схема, фази. Клітини і гуморальні фактори, які беруть участь в імунній відповіді.

2. Класи імуноглобулінів(Іg): перелік, властивості, функції, визначення.

3. Антитіла: визначення, властивості, одержання, практичне використання, моноклональні антитіла.

4. Реакція аглютинації, механізми, різновиди, практичне використання.

5. Аглютинуючі сироватки: приготування, титрування, практичне використання.

6. Реакція преципітації: визначення, механізм, різновиди, практичне використання.

7. Преципітуючі сироватки: приготування, титрування, практичне використання.

При підготовці до заняття користуйтеся літературою:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ Под ред. А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 286 - 288.

2. П‘яткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією: підручник. – К.: Вища школа, 1992. – С. 177 - 179.

3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.: ООО «МИА», 2001. – С. 330 – 334.

4. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. – М.: ГЭОТАР, 2001. – С. 246 – 247.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – СПб., 2002. – С. 232 - 233.

6. Климнюк СІ., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. - Тернопіль, 2004. с. 137-140.

7. Каплін М.М. Імунна система: фізіологія і патологія: навч.посібник. Суми, 2002. – С. 124.

8. Пояснення до самостійної роботи (додаток 1).

9. Графи логічної структури (додаток 2).

ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ

1. Поставити реакцію аглютинації на склі для визначення виду бактерій Приготувати препарат з аглютинату, пофарбувати фуксином, мікроскопіювати.

2. Поставити розгорнуту реакцію аглютинації для серологічної діагностики бруцельозу.

3. Поставити реакцію кольцепреципітації для визначення видової приналежності кров'яної плями. Записати в протокол реакцію, провести облік результатів і висновок.

4. Вивчити демонстрацію.

Алгоритм практичної роботи

Робота 1. На предметне скло нанести краплю аглютинуючої сироватки 1:10 - 1:20, поруч помістити краплю фізрозчину для контролю. Петлею візміть невелику кількість культури зі скошеного агару І рівномірно емульгуйте її у фізрозчині та сироватці. При позитивній реакції аглютинації з’являються пластівці, а контрольна краплина фізрозчину залишається рівномірно мутною.

Робота 2. Для визначення титру протибруцельозних антитіл у реакції" розгорнутої аглютинації візьміть 7 пробірок ( табл. 1). У першу пробірку внесіть 1 мл вихідного розведення сироватки (1:50) і в усі 6 пробірок також градуйованою піпеткою внесіть по 1 мл фізіологічного розчину. У першій пробірці одержимо розведення сироватки 1:100 при обсязі 2 мл . З першої пробірки 1 мл перенесіть у другу пробірку, де розведення стане 1:200. Так зробіть ряд послідовних розведень сироватки в 5 пробірках(1:100,1:200,1:400,1:600). З п’ятої пробірки 1 мл вилийте в дезрозчин. В усі 7 пробірок додайте по 2 краплини бруцельозного діагностикуму. Сьома пробірка є контролем

культури, тому що містить тільки фізіологічний розчин і діагностикум. Такий контроль необхідний для виключення спонтанної аглютинації культури. Пробірки струшують і поміщають у термостат при температурі 37° на 2 години, а потім залишають на добу при кімнатній температурі, після чого роблять облік результатів реакції аглютинації.

Таблиця 1

	Схема постановки реакції розгорнутої					а гл юти най	її
Компонент	1	2	3	4	5	6 контроль сироватки	7 контроль діагнос-тикума
Фізіологічний	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
розчин, 7 мл Аглютинуюча	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	,.
тифозна
сироватка в
розведенні 1:50, 2мл
Черевнотифо­зний	2	2	2	2	2	„	2 Г
діагностикум ( краплі) Розведення сироватки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:100
Результат						..
реакції

Висновок: ___________________________________________________________

Робота 3. Для постановки реакції кольцепреципітації для визначення видової приналежності кров'яної плями, у вузькі пробірки, які встановлені в однорядовому штативі наливають компоненти (таблиця 2) в 1-шу 0,2 мл преципітуючої сироватки проти білка крові людини, в 2-гу – 0,2 мл преципітуючої сироватки проти білка крові барана, в 3-тю – 0,2 мл фізіологічного розчину. Потім обережно по стінці пробірки, за допомогою тонкої пастерівської піпетки, нашаровують екстракт кров‘яної плями «Х» в кількості 0,2 мл. При правильному нашаровуванні повинна бути чітко видна границя між антигеном та сироваткою. Реакцію враховують після інкубації у термостаті пробірок протягом 30 хвилин, при температурі 25 – 26⁰С. При позитивному результаті на границі двох рідин утворюється щільна біле кільце. Провесдіть облік результату реакції, внесіть його у протокол.

Таблиця 2

Інгредієнти	Номер пробірки
	1	2	3
1. Преципітуюча сироватка проти білка крові людини (мл)	0,2	-	-
2. Преципітуюча сироватка проти білка крові барана (мл)	-	0,2	-
3. Фізіологічний розчин (мл)	-	-	0,2
4. Екстракт кров'яної плями «Х» (мл)	0,2	0,2	0,2
Результат (утворення преципітату)

Висновок: _____________________________________________________________________

Демонстрація

1. Реакція непрямої гемаглютинації (рнга).

У цій реакції мікробний або розчинний антиген адсорбується на поверхні еритроцитів (еритроцитарний діагностикум), які у такому «навантаженому» стані отримують здатність до аглютинації з імунною сироваткою, яка містить специфічні проти мікробного антигену антитіла. Враховується реакція по утворенню аглютинованими еритроцитами осаду у вигляді парасольки на дні заглиблень (лунок), у той час як у контролі, без імунної сироватки, вони осідають у центрі, утворюючи «ґудзик» з рівними краями. Реакція непрямої гемаглютинації є більш чутливою, ніж аглютинація бактерій, застосовується для діагностики при багатьох інфекційних захворюваннях, особливо у дітей, при необхідності виявлення антитіл у більш низьких титрах. Ця реакція може бути використана І для виявлення антигенів при застосуванні антитільних діагностикумів.

2. Реакція преципітації в гелі.

Для визначення токсигенності дифтерійних культур на чашку з агаром поміщається смужка фільтрувального папіру, змочена антитоксичною сироваткою, що містить у 1 мл 500 МО, потім роблять посів дифтерійних культур бляшками на відстані 1 см від краю смужки. Якщо культура продукує екзотоксин, він дифундує в живильне середовище і дає утворення преципітату з антитоксичною сироваткою у вигляді тонких ліній.

2. Імунні сироватки і імуноглобуліни (антитоксичні, преципітуючі).

Імунні антитоксичні сироватки і імуноглобуліни застосовуються для специфічної профілактики і лікування ряду інфекційних захворювань. При цьому створюється пасивний імунітет.

Антитоксичні сироватки готують шляхом гіперімунізації коней відповідними анатоксинами. Гіперімунізацію проводять шляхом багаторазового введення анатоксину за певними схемами. За титр сироватки приймається кількість антитоксичних одиниць які містяться в 1 мл. Титрування антитоксичної сироватки проводиться на лабораторних тваринах або в реакції флокуляції in vitro. Якщо титрування проводиться на тваринах, то за 1 антитоксичну одиницю (АО) приймається мінімальний об‘єм сироватки в мілілітрах, який нейтралізує певну кількість DLM відповідного токсину. Наприклад, за 1 АО протидифтерійної сироватки приймається мінімальний її об‘єм, який нейтралізує - 100 DLM дифтерійного токсину, для морських свинок вагою 250 грамів.

Якщо титрування проводиться в реакції флокуляції, то за 1 АО антитоксичної сироватки приймається її мінімальний об‘єм в мілілітрах, який при взаємодії з однією імуногенною (антигенною) одиницею відповідного анатоксину зумовлює (викликає) ініціальну (початкову) флокуляцію.

При досить високому титрі антитіл в сироватці коня роблять часткове кровопускання і після згортання крові відділяють сироватку. Отримані антитоксичні сироватки фільтруються через бактеріальні фільтри і піддають відчищенню концентрації, що засновано на видаленні із сироватки баластних білків (альбумінів і еуглобулінів) з наступною концентрацією імуноглобулінів. У ряді випадків роблять фракціонування сироваток сульфатом амонію й обробку їх протеолітичними ферментами (пепсином). При застосуванні ферментації титр зростає в 5-10 разів, анафілоктогенні властивості препарату зменшуються. Всі імунні сироватки перед їхнім випуском піддають контролю.

Сироватки повинні містити певний титр антитіл, бути стерильними і непірогенними. Застосовуються сироватки для профілактики і лікування інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксин (дифтерія, правець, газова гангрена, ботулізм).

Удосконалення сироваткових препаратів завершується одержанням імунних гамма-глобулінів, що відрізняються від очищених сироваток тим, що в них зведений до мінімуму вміст інших білків.

Гомологічний гамма-глобулін готують із сироватки людей-добровольців, імунізованих проти різних вірусних або бактеріальних інфекцій, або із сироваток крові реконвалісцентів. Застосовуються для лікування і профілактики протикашлюковий імуноглобулін, протиправцевий, протигрипозний, протикоровий та інші імуноглобуліни. Для одержання імуноглобуліну із сироватки крові людей використовують різні методи:

1. висолювання сульфатом амонію;

2. спиртове осадження по Коні;

3. препаративний електрофорез;

4. гельфільтрація через молекулярні сита;

5. іонообмінна хроматографія й інші.

Імуноглобулін із сироватки людей являє собою гомогенний препарат, що рідко викликає у людей алергічні реакції. Гомологічні антитіла швидше надходять у кров і довше в ній зберігаються.