Денисенко 4 сем (билеты)

др.), глутатион (у глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы), мононуклеотиды (АМФ, ГМФ, ЦМФ) и др.

11.Виды специфичности ферментов. Примеры простетических групп.

Специфичность - наиболее важное свойство ферментов, определяющее биологическую значимость этих молекул. Различают субстратную и каталитическую специфичности фермента, определяемые строением активного центра

1. Субстратная специфичность Под субстратной специфичностью понимают способность каждого фермента

взаимодействовать лишь с одним или несколькими определёнными субстратами. Различают:

•абсолютную субстратную специфичность;

•групповую субстратную специфичность;

•стереоспецифичность.

Абсолютная субстратная специфичность

Активный центр ферментов, обладающих абсолютной субстратной специфичностью, комплементарен только одному субстрату. Следует отметить, что таких ферментов в живых организмах мало.

Пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - аргиназа, катализирующая реакцию расщепления аргинина до мочевины и орнитина:

Другой пример фермента с абсолютной субстратной специфичностью - уреаза, катализирующая гидролиз мочевины до диоксида углерода и аммиака.

Групповая субстратная специфичность

Большинство ферментов катализирует однотипные реакции с небольшим количеством (группой) структурно похожих субстратов.

Так, фермент панкреатическая липаза катализирует гидролиз жиров в двенадцатиперстной кишке человека, катализируя превращение любой молекулы жира (триацилглицерола) до молекулы моноацилглицерола и двух молекул высших жирных кислот. Панкреатическая липаза гидролизует эфирную связь у α-атомов углерода глицерола, независимо от того, какие жирные кислоты входят в состав молекулы жира

Большинство протеолитических ферментов, осуществляющих гидролиз белков, имеет групповую субстратную специфичность, гидролизуя пептидные связи, образованные разными аминокислотами.

Стереоспецифичность

При наличии у субстрата нескольких стерео-изомеров фермент проявляет абсолютную специфичность.

к одному из них. В организме человека наблюдают специфичность ферментов к следующим стереоизомерам.

2. Каталитическая специфичность Фермент катализирует только одно превращение субстрата из всех возможных. Это

свойство обеспечивается строением каталитического участка активного центра фермента и называется каталитической специфичностью, или специфичностью пути превращения субстрата. Так, молекула глюкозо-6-фосфата в клетках печени человека - субстрат 4 различных ферментов; фос-фоглюкомутазы, глюкозо-6-фосфатфосфатазы, фосфоглюкоизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Однако из-за особенностей строения каталитических участков этих ферментов происходит различное превращение этого соединения с образованием 4 различных продуктов.

Простетические группы (фад, фмн, биотин, гем)

Данная органическая молекула занимает такое положение, в котором она может эффективно содействовать каталитической функции своего фермента.

Пример 2. Гем — это железосодержащая простетическая группа. Его молекула имеет форму плоского кольца, в в центре которого находится атом железа (порфириновое кольцо, такое же, как у хлорофилла). Гем выполняет в организме ряд биологически важных функций. Перенос электронов. В качестве простетической группы цитохромов гем выступает как переносчик электронов. Присоединяя электроны, железо восстанавливается до Fe(II), а отдавая их, окисляется до Fe(III). Гем, следовательно, принимает участие в окислительно-восстановительных реакциях за счет обратимых изменений валентности железа. Перенос кислорода. Гемоглобин и миоглобин — два гемсодержащих белка, осуществляющих перенос кислорода. Железо находится в них в восстановленной форме. Каталитическая функция. Гем входит в состав каталаз и пероксидаз, катализирующих расщепление перекиси водорода и воды.

Коферменты (над, надф, кофермент а, атф)

Пример. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД), производная никотиновой кислоты, может существовать как в окислительной, так и в восстановительной форме. В окислительной форме НАД при катализе играет роль акцептора водорода:

Здесь E1 и E2 — две различные дегидрогеназы. Конечный результат: 2H переносятся от A к B. Здесь в качестве связующего звена между двумя различными ферментными системами E1 и E2 действует кофермент.

12.Зависимость скорости ферментативной реакции от рН, температуры, концентрации фермента, субстрата.

Кинетика ферментативных реакций - раздел энзимологии, изучающий зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ, а также от факторов окружающей среды.

Для измерения каталитической активности ферментов используют такие показатели, как скорость реакции или активность фермента.

Математически скорость ферментативной реакции выражается в изменении концентрации субстрата (уменьшение) или продукта (увеличение) за единицу времени:

V= D[S]/t = D[P]/t.

На начальном этапе [0 - t0] скорость реакции прямо пропорциональна времени и имеет линейную зависимость. Графически изменение скорости ферментативной реакции определяется тангенсом угла наклона касательной к кривой профиля реакции. Чем больше угол наклона, тем больше изменение скорости реакции.

С течением времени изменение скорости ферментативной реакции в экспериментальных условиях уменьшается, об этом свидетельствует уменьшение угла наклона касательной в момент времени t. Снижение скорости ферментативной реакции может происходить за счёт ряда факторов: уменьшения концентрации субстрата, увеличения концентрации продукта,рН раствора, инактивация фермента и т.д.

На этапе [t1 - tx] скорость реакции изменяется нелинейно в зависимости от времени. Поэтому для определения скорости ферментативной реакции чаще всего исследуют изменение скорости на начальном этапе [t0 - t1], где наблюдают линейное изменение концентрации продукта (или субстрата).

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет зависеть от концентрации фермента.

на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: одна международная единица активности (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных

условиях проведения ферментативной реакции.

Количество единиц активности nME определяют по формуле:

В 1973 г. была принята новая единица: 1 катал (кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с.

n катал =количество превращенногосубстрата (моль)/время (с)

Международная единица ферментативной активности ME связана с каталом следующими равенствами:

1 кат = 1 моль S/c = 60 моль S/мин = 60х106 мкмоль/мин = 6х107 ME,

1 ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность (уд. ак.) фермента, численно равную количеству единиц активности фермента (пМЕ) в образце ткани, делённому на массу (мг) белка в этой ткани:

Уд. ак. =

Количество превращённого субстрата (мкмоль)

Время (мин) × Количество белка (мг)

По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.

Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды

С повышением температуры ускоряется движение молекул, что приводит к повышению вероятности взаимодействия реагирующих веществ. температура может повышать энергию реагирующих молекул, что также приводит к ускорению реакции. скорость химической реакции свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением активности, возникающим из-за термической денатурации белковой молекулы.

Для большинства ферментов человека оптимальна температура 37-38 °С. Однако в природе существуют и термостабильные ферменты.

Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды

Для каждого фермента существует значение рН, при котором наблюдается его максимальная активность. Отклонение от оптимального значения рН приводит к понижению ферментативной активности.

Влияние рН на активность ферментов связано с ионизацией функциональных групп аминокислотных остатков данного белка, обеспечивающих оптимальную конформацию

активного центра фермента. При изменении рН от оптимальных значений происходит изменение ионизации функциональных групп молекулы белка. Кроме того, рН среды может влиять на степень ионизации или пространственную организацию субстрата, что также влияет на сродство субстрата к активному центру. При значительном отклонении от оптимального значения рН может происходить денатурация белковой молекулы с полной потерей ферментативной активности.

Оптимум значения рН у разных ферментов различный. Ферменты, работающие в кислых условиях среды (например, пепсин в желудке или лизосомальные ферменты), эволюционно приобретают конформацию, обеспечивающую работу фермента при кислых значениях рН. Однако большая часть ферментов организма человека имеет оптимум рН, близкий к нейтральному, совпадающий с физиологическим значением рН.

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата

Если концентрацию ферментов оставить постоянной, изменяя только количество субстрата, то график скорости ферментативной реакции описывают гиперболой.

При увеличении количества субстрата начальная скорость возрастает. Когда фермент становится полностью насыщенным субстратом, т.е. происходит максимально возможное при данной концентрации фермента формирование фермент-субстратного комплекса, наблюдают наибольшую скорость образования продукта. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта, т.е. скорость реакции не возрастает. Данное состояние соответствует максимальной скорости реакции

Vmax.

Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением:

где k1 - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса; k-1 - константа скорости обратной реакции, распада фермент-субстратного комплекса; k2 - константа скорости образования продукта реакции.

Следующее соотношение констант скоростей (k-1 + k2)/k1 называют константой Михаэлиса и обозначают Кm.

Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса ES, a скорость образования ES зависит от концентрации субстрата и концентрации свободного фермента. На концентрацию ES влияет скорость формирования и распада ES.

Наибольшая скорость реакции наблюдается в том случае, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом, т.е. в фермент-субстратном комплексе ES, т.е. [Е] =

[ES].

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике):

Vmax[S]	V =
Km + [S]	Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен.

описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации

субстрата.

Если концентрация субстрата значительно больше Km (S >> Km), to увеличение

концентрации субстрата на величину Кm практически не влияет на сумму (Km + S) и её

можно считать равной концентрации субстрата. Следовательно, скорость реакции становится равной максимальной скорости: V = Vmax. В этих условиях реакция имеет

нулевой порядок, т.е. не зависит от концентрации субстрата. Можно сделать вывод, что Vmax - величина постоянная для данной концентрации фермента, не зависящая от

концентрации субстрата.

Если концентрация субстрата значительно меньше Km(S << Km), то сумма (Km + S) примерно

равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо

пропорциональна

Vmах и Km - кинетические характеристики эффективности фермента.

Vmax дает характеристику каталитической активности фермента и имеет размерность

скорости ферментативной реакции моль/л, т.е. определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата. Кm характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является величиной постоянной, не зависящей от концентрации фермента. Чем меньше Кm, тем больше

сродство фермента к данному субстрату, тем выше начальная скорость реакции и наоборот, чем больше Кm, тем меньше начальная скорость реакции, тем меньше сродство

фермента к субстрату.

Зависимость от концентрации

Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (график Михаэлиса-Ментен)

13.Обратимые и необратимые ингибиторы ферментов. Характерные черты конкурентного, неконкурентного и бесконкурентного ингибирования.

На активность ферментов оказывают влияние множество факторов, среди которых важную роль играют ингибиторы, воздействие которых снижает активность ферментов. Различают обратимое и необратимое ингибирование. Необратимый ингибитор или каталитический яд, взаимодействуя с ферментом, снижает его активность до нуля. Обратимые ингибиторы, в отличие от необратимых образуют с ферментом динамический комплекс, отличающийся по своим кинетическим свойствам от свободного фермента. Характерная черта обратимого ингибирования – наличие равновесия между ферментом и ингибитором. При этом константа равновесия или константа ингибирования (Кi) служит

мерой сродства фермента и ингибитора и выражает эффективность действия ингибитора. Можно выделить четыре типа обратимого ингибирования: конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное и ингибирование смешанного типа.

Общая схема ингибирования:

•Конкурентный ингибитор – это соединение, обладающее структурным сходством с субстратом. Поэтому такой ингибитор способен взаимодействовать с активным центром фермента, конкурируя с истинным субстратом.

При этом типе ингибирования увеличивается Km. Скорость реакции снижается, так как

комплекс фермент-ингибитор является неактивным (не распадается с образованием продуктов). Однако максимальная скорость реакции (Vmax) не изменяется.

•Неконкурентное ингибирование

В случае неконкурентного ингибирования ингибитор не оказывает влияния на взаимодействие фермента и субстрата, уменьшая скорость реакции

(Vmax(каж)<Vmax).

Где Vmax(каж) имеет значение:

(4)

Степень ингибирования зависит от концентрации ингибитора и не зависит от концентрации субстрата.

•Бесконкурентное ингибирование

Этот тип ингибирования наблюдается в случае, когда ингибитор способен связываться исключительно с фермент-субстратным комплексом.

Схема бесконкурентного ингибирования:

При данном типе ингибирования в равной степени изменяется какконстанта Михаэлиса, так и максимальная скорость реакции:

.

Где

•Смешанный тип ингибировния

В случае двухсубстратных реакций при определенной концентрации ингибитора часто можно наблюдать ингибирование смешанного типа.

При этом Ki1 ≠ Ki2. Изменяются как константа Михаэлиса, так и максимальная скорость, но не в одинаковой степени:

Смешанное конкурентное-неконкурентное ингибирование. В этом варианте ингибирования Ki2˃ Ki1. Сродство фермента к субстрату в присутствии ингибитора данного типа увеличивается, а максимальная скорость ферментативной реакции снижается

,

Смешанное неконкурентное-бесконкурентное ингибирование. В этом случае

Ki1 ˃ Ki2. Этот ингибитор снижает и константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции

Примером смешанного ингибирования является воздействие ртутьорганического соединения мертиолата на сахаразу грибов. Это вещество широко используется в промышленности для подавления роста микромицетов.

14.Регуляция активности ферментов.

Вещества, изменяющие активность ферментов, называют регуляторами. Они делятся на ингибиторы, снижающие ферментативную активность, и активаторы, повышающие ферментативную активность. Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. Обратимые ингибиторы связываются с ферментами слабыми нековалентными связями и при определенных условиях легко отделяются от фермента, действуют кратковременно. Обратимые ингибиторы делятся на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентные ингибиторы имеют структурное сходство с субстратом, в результате чего возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за связывание с активным центром фермента. В этом случае с активным центром взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат(ЕS) или фермент-ингибитор (ЕI). При формировании ЕI комплекса продукт реакции не образуется. Активность фермента может быть восстановлена при повышении концентрации субстрата. Многие лекарственные препараты действуют как конкурентные ингибиторы. Например, сульфаниламиды, обладающие бактериостатическим действием, являются аналогами пара-аминобензойной кислоты, которую бактерии используют для синтеза фолиевой кислоты (необходимой для синтеза нуклеотидов и деления клеток).

Неконкурентные ингибиторы не похожи на субстрат, поэтому взаимодействуют с ферментом в участке, отличном от активного центра.

Необратимые ингибиторы образуют прочные ковалентные связи с ферментом, при этом чаще модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять свою каталитическую функцию. Например, фосфорорганические соединения ковалентно связывают ОН-группу серина, находящуюся в активном центре и играющую ключевую роль в процессе катализа. Такие ингибиторы, если используются как лекарства, действуют длительно (сутки, недели). Восстановление ферментативной активности может быть связано с синтезом новых молекул фермента.

Большинство ферментативных процессов в клетке протекают не в одну стадию, а представляют собой совокупность ферментативных реакций, объединенных в ферментативные цепи (метаболические пути), которые могут быть линейными (гликолиз), разветвленными, циклическими (цикл Кребса). Чтобы воздействовать на скорость метаболического пути, достаточно регулировать количество или активность ферментов. В метаболических путях нет надобности регулировать активность всех ферментов, обычно регулируется активность ключевых ферментов, которые определяют скорость

метаболического процесса в целом. Ключевыми ферментами являются:

•ферменты начала метаболического пути (первый фермент),

•ферменты, катализирующие скорость-лимитирующие (самые медленные) реакции,

•ферменты, находящиеся в месте разветвления метаболических путей.

Регуляция скорости ферментативных реакций может осуществляться путем:

•изменения количества молекул фермента,

•доступностью молекул субстрата и кофермента,

•регуляции каталитической активности молекул отдельных ферментов.