7.3. А. Определение активности -амилазы в моче

-Амилаза (КФ 3.2.1.1) – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4--гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

В организме человека основными источниками -амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует 2 семейства изоферментов амилазы, соответственно P и S.

Изоферменты P – образуются только в поджелудочной железе. Изоферменты S – преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности -амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

Резкое (в 10-30 раз) повышение активности -амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность -амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности -амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившимся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину.

В результате получают ряд последовательных разведений мочи (1:2; 1:4; 1:8 и т.д. Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Результаты окраски растворов в пробирках заносят в таблицу:

Проба	1	2	3	4	5	6
Разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска с иодом

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность -амилазы.

Расчет активности -амилазы

За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность необходимую для расщепления 1 мл 0,1% раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин.

А = 2 ^. Р [ед. Вольгемута]

2 (мл) – объем 0,1% крахмала

Р – разведение (см. таблицу), например 1-я пробирка – разведение 2,

6-я пробирка – разведение 64.

Норма: от 16 до 64 условных единиц Вольгемута.

Выводы

7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии

Для обеспечения нормальной жизнедеятельности химический состав организма должен быть относительно постоянным. Для этого необходимы процессы удаления избытка воды и электролитов, а также продуктов метаболизма. Основным органом, регулирующим состав водо-растворимых химических компонентов организма, являются почки. В составе мочи обнаружено более 150 химических ингредиентов. Следует отметить, что широко используемое понятие «патологические компоненты мочи» в известной мере условно, так как большинство соединений, рассматриваемых как патологические компоненты мочи, хотя и в небольшом количестве, но могут присутствовать в нормальной моче. Другими словами, речь идет о веществах, которые в моче здорового человека не встречаются в аналитически определяемых количествах. Это, прежде всего белки, глюкоза, кетоновые тела, билирубин и гемоглобин.

Для обнаружения этих веществ можно использовать экспресс-методы полуколичественного анализа. Это так называемые тест-полоски.

Цель работы

Провести экспресс-тесты с 5 образцами мочи. Определить рН каждого из образцов, а также содержание белка, кетоновых тел, глюкозы. Проанализировать полученные результаты.

Принцип метода

О концентрации того или иного реагента можно судить по изменению окраски сенсорной зоны, сопоставив полученный результат с соответствующей цветной шкалой на упаковке.

Сенсорная или реакционная зона любой тест-полоски (для определения глюкозы, кетонов, белка, нитритов, билирубина, уробилиногена и т.д.) представляет собой некую матрицу, в которой находится много различных сбалансированных  химических компонентов.  Наряду с химическими компонентами в некоторые сенсорные зоны тест-полосок вводят ферменты, специфически взаимодействующие с определяемым веществом в пробе. Тест-полоски с наличием ферментов в сенсорной  зоне называют ферментативными.

Чтобы результаты были корректными, определение необходимо проводить в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией по применению.

Реагенты, используемые в сенсорной зоне (см. приложение ).

№ п/п	Анализируемое соединение	Рабочий реагент
1	белок	Эфир тетрабромфенолфталеина, тетрабромфеноловый синий
2	глюкоза	Глюкозооксидаза, пероксидаза, тетраметилбензидин
3	кетоновые (ацетоновые) тела	Натрия нитропруссид
4	рН	Метиловый красный, бромтимоловый синий

Примечание:

Белок - проба наиболее чувствительна к альбумину, значительно менее чувствительна к глобулинам, мукопротеинам, гемоглобину и белку Бенс-Джонса. На определение белка не влияет величина рН мочи, но в сильно щелочной моче (рН выше 8) или в моче с высокой буферной емкостью тест может дать ложноположительные результаты. Не обращайте внимания на окраску сухой зоны.

Определение глюкозы основано на ферментативной (глюкозаоксидаза/пероксидаза) реакции, тест специфичен для глюкозы, другие сахара не взаимодействуют. Реакция не зависит от рН и присутствия кетоновых тел.

Кетоны - проба значительно чувствительнее к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону. С бета-гидроксимасляной кислотой проба не реагирует. Лекарственные и диагностические препараты на основе фенолфталеина или сульфонфталеина, присутствующие в моче, могут в щелочной среде зоны окрашиваться в красный и даже пурпурный цвет. Цветная шкала сравнения на этикетке отражает концентрацию ацетоуксусной кислоты в моче.

Предварительно лаборанты готовят 5 образцов: один с нормальной мочой, а каждый следующий отличается от нормы по одному из исследуемых показателей.

Выполнение работы

Тест-полоску опускают на 1-2 с. в исследуемый образец так, чтобы сенсорные зоны были смочены. Капли мочи с полоски удаляют, проведя полоской по краю сосуда с мочой. Полоску оставляют в горизонтальном положении. Приблизительно через 60 с. сопоставляют окраску зон индикации с соответствующей цветной шкалой.

Оформление работы

	I обра-зец	II обра-зец	III обра- зец	IV обра- зец	V обра- зец
рН
Белок
Глюкоза
Кетоно-вые тела

Выводы

Тестовые задания по теме: «Интеграция обмена основных классов органических соединений. Использование ферментов в медицине»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Анаболические и катаболические процессы чаще всего разобщены пространственно.

2. Основное количество АТФ для биоситеза белка образуется за счет окислительного фосфорилирования.

3. Печень занимает центральное место в обмене белков, углеводов и липидов.

4. Активность трансаминаз в сыворотке крови в норме значительно выше, чем в тканях.

5. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови повышается при рахите.

6. Определение активности кислой фосфатазы сыворотки крови специфично для заболеваний предстательной железы.

7. Повышается ли активность амилазы при панкреатитах?

8. Используется ли L-аспарагиназа для лечения лейкозов?

9. Информативно ли электрофоретическое разделение белков сыворотки крови?

10. Определяют ли активность КФК в сыворотке крови для диагностики заболеваний печени?

11. Повышается ли содержание изоферментов ЛДГ₁ и ЛДГ₂ при инфаркте миокарда?

12. Специфичен ли глюкозоксидазный метод определения глюкозы?

2) Выбрать один правильный ответ

Синтез АТФ из АДФ в печени происходит, в основном, путем: реакции с ГТФ окислительного фосфорилирования субстратного фосфорилирования взаимодействия с ФФн реакции с ЦТФ

При инфаркте миокарда в крови положительны следующие тесты: повышение активности АсАТ и АлАТ увеличение содержания ЛДГ1 и ЛДГ2 повышение активности КФК увеличение содержания МВ-изоформы КФК положительны все перечисленные тесты

3) Установить соответствие суточного выделения с мочой в норме следующих метаболитов:

1. мочевина 2. креатинин 3. мочевая кислота 4. хлорид натрия

А. 0,6 г/сут Б. 30 г/сут В. 10 г/сут Г. 1,5 г/сут