8.5.4. Нарушения развития мозга мыши. Неврологические мутации

Используя мутации, затрагивающие морфогенез мозга, прижизненное окрашивание отдельных клеток с последующим прослеживанием распределения метки, а также создание мышей-химер, можно проследить судьбу отдельных клеточных клонов при развитии мозга и выявить характер взаимодействия между ними. Важным свойством дифференцировки нейробластов млекопитающих является определение окончательных свойств нейронов на таких стадиях развития, когда фенотипически клетка еще не дифференцирована.

Какие же характерные для нейрона свойства должна проявить такая рано детерминированная клетка в ходе дифференцировки? К ним относятся: особенности морфологического строения, медиатор-ная специфичность, определенный характер ее связей с другими нейронами, общее число нейронов данного фенотипа, а также определенный численный баланс клеток разных популяций.

Очевидно, что генетическая программа развития нейрона развертывается на основе тех эпигенетических механизмов, о которых упоминалось выше. Все перечисленные выше свойства детерминированной нервной клетки формируются как результат экспрессии соответствующих генов в определенные моменты времени, которые совпадают с формированием (вследствие работы других групп генов) градиентов концентрации биологически активных веществ (гормонов, факторов роста и др.) – компонентов внешней среды нейрона, необходимых для его развития.

Большой фактический материал по развитию ЦНС, в частности, при неврологических мутациях мыши, заставляет сделать вывод, что мутационные события или внешние экспериментальные воздействия могут значительно повлиять на окончательное пространственное положение нейронов, но не на их форму или функциональные свойства. Ниже это иллюстрируется более подробным описанием неврологических нарушений при некоторых мутациях.

Следует отметить, что изучение неврологических мутаций мыши дало огромный материал для понимания генетического контроля пре- и постнатального онтогенеза мозжечка. Особое значение, которое придается этим данным, связано с тем, что подобные мутации могут служить удобными и полезными моделями генетических дегенеративных заболеваний человека. Это относится прежде всего к мутациям "демиелинизации", например jimpy, shiverer и др. Молекулярная биология этих мутантных генов изучена достаточно подробно.

У собак описана мутация демиелинизации – "shaking pup". Она рецессивна и сцеплена с ^-хромосомой. Дефекты этого типа затрагивают синтез эволюционно консервативных белков миелина. Де-миелинизация, при которой ухудшаются условия проведения нервных импульсов по аксонам, сопровождается снижением всех функций мозга и гибелью животного. При "shaking pup" дефект, по всей видимости, связан с заменой одной пары оснований в гене, кодирующем один из таких белков. Столь сильные изменения в функциональных свойствах белков миелина определяются, по всей видимости, именно большим эволюционным консерватизмом белков этой группы. У мутантных особей, начиная с 10–12-дневного возраста, появляется мышечный тремор (характерный для мутаций демиелинизации у всех видов млекопитающих). У мутантных собак, в отличие, например, от некоторых мутаций мышей, миелин разрушается не полностью, и они живут относительно дольше, чем му-тантные крысы и мыши. В то же время у 4–16-месячных мутантных щенков количество миелина составляет лишь 2,4% от контроля. У таких собак резко снижено количество олигодендроцитов – глиальных клеток, продуцирующих миелин.

Неврологические мутации мыши имеют аутосомную локализацию. Они, за редкими исключениями, рецессивны, их наиболее частый и наиболее заметный морфологический дефект – недоразвитие органов внутреннего уха и/или мозжечка. Мыши с неврологическими мутациями характеризуются нарушениями движений, походки, аномалиями позы, отклонениями в поведении и в способности к обучению.

Нейроны большинства корковых структур мозга млекопитающих образуются в генеративных зонах, которые пространственно отделены от мест расположения этих клеток во взрослом мозге. Так, предшественники нейронов древней (обонятельной) и старой (аммонов рог) коры, а также новой коры формируются в вентрикулярных и субвентрикулярных зонах переднего мозга. Предшественники гранулярных клеток зубчатой фасции гиппокампа формируются in situ, предшественники клеток Пуркинье – в вентральной зоне вдоль дорсального края 4-го желудочка, а разные классы клеток коры мозжечка образуются в пространстве между наружным гранулярным слоем и развивающимся молекулярным слоем.

По окончании митозов большая часть корковых нейробластов мигрирует на значительные расстояния. На окончательных позициях они распределяются по слоям (выявляется дифференцировка на классы) в направлении (в случае корковых структур) от внутреннего слоя к наружному.

И зучение мутаций reeler и weaver показало, что на окончательное положение нейронов в слоях влияют два независимых нейрогенети-ческих механизма – миграция клеток и распределение их по слоям. В то же время ключевые события, вызывающие нарушения и га-бель клеток наружного гранулярного слоя мозжечка, происходят еще раньше (примерно в первый день после рождения).

При мутации reeler развитие гранулярных клеток замедляется, отмечается также их ускоренная гибель. Нарушение цитоархитектоники мозжечка, а в случае мутации reeler еще коры и гиппокампа, – лишь наиболее заметный эффект этой группы неврологических мутаций (рис. 8.21).

У reeler выявлены отклонения в строении ряда ядер продолговатого мозга и базальных ганглиев, а также в особенностях распределения на нейронах рецепторов разных классов. При этой мутации (rt) нарушено расположение слоев корковых структур. Аномальная стратификация обнаруживается у них с момента закладки корковой пластинки (13–14-й дни эмбрионального развития). Полиморфный слой клеток располагается на поверхности, слои мелких пирамид (в норме это 3-й и 4-й слои) находятся в глубине, тогда как 5-й слой нормального мозга – ближе к поверхности. Характер распределения восходящих моноаминергических волокон в подкорковых структурах не отличается от нормы, однако их распределение по слоям коры у rl имеет характерные черты. Эти афференты не ветвятся в наружном слое коры и не идут каждое отдельно, а собираются в пучки. В то же время места их окончаний в нормальном и мутантном мозге гомологичны.

Таким образом, нарушение архитектоники слоев новой коры не препятствует "узнаванию" растущими волокнами соответствующих клеток-мишеней.

На срезах мозга мышей, гомозиготных по rl, было показано, что при этой мутации ослаблен процесс формирования долговременной постсинаптической потенциации, а в stratum radiatum и stratum moleculare-lacunosum присутствует множество клеток, иммунореак-тивных к парвальбумину (нередко это свойство находят у ГАМК-ер-гических вставочных нейронов).

Нормальный аллель гена rl обеспечивает, таким образом, сопряжение во времени и в пространстве процессов миграции и созревания клеточных элементов.

Считается, что наиболее правдоподобны два объяснения причин дефекта строения мозга при мутации rl: уменьшение сил сцепления (адгезии) между нейронами и волокнами радиальной глии к концу периода миграции и изменение этих сил в постмиграционный период. Было действительно продемонстрировано, что в коре мышей-мутантов по rl глиальные волокна располагаются тангенциально к боковым стенкам формирующихся "бочонков" – специфических агрегаций корковых нейронов, а не радиально, как в норме. Полагают, что в развивающейся коре радиальные глиальные волокна служат "гидами" для мигрирующих молодых нейробластов, которые проделывают свой путь к коре из вентральной зоны, где происходят митозы.

При исследовании гистогенеза мозжечка у мышей-химер, т.е. у животных, ткань мозга которых состояла из нормальных и мутант-ных клеточных элементов, была подтверждена роль глиальных элементов. В целом для мутации rl характерно общее недоразвитие мозжечка с почти полным отсутствием клеток-зерен. Клетки Пур-кинье у этих мутантов (а также при ряде других мутаций) развиваются в отсутствие контактов с аксонами гранулярных клеток – параллельными волокнами, вместо которых с клетками Пуркинье контактируют мшистые волокна, в норме приходящие в гранулярный слой. При этой мутации клетки Пуркинье расположены беспорядочно и не формируют четкого слоя. У мышей-химер аномальные участки мозжечковой коры "вкраплены" в кору с нормальной структурой. В то же время клетки Пуркинье, которые маркированы как генотип rl/rl, можно найти как в нормальных, так и в му-тантных участках ткани.

Согласно результатам иммуногистохимического исследования мозжечка, влияние мутации rl на миграцию элементов может осуществляться в более ранние сроки, еще до начала миграции. Возможно, что эффект действия мутантного гена начинается в период формирования нейробластов.

У мышей-химер, "составленных" из нормальных клеток и генотипа staggerer (sg), в клетках Пуркинье мутантного фенотипа присутствуют все аномалии строения, свойственные этой мутации. Известно, что у мутантов sg гранулярные клетки мигрируют и дифференцируются нормально, но к 4-й неделе жизни начинают прогрессивно дегенерировать, а клетки Пуркинье при этой мутации сохраняются в количестве 10% от нормы.

При мутации weaver (wv) дефект обусловлен отсутствием миграции гранулярных клеток и последующей их дегенерацией. Таким образом, мутантный локус действует непосредственно на гранулярные клетки.

Примером еще одного типа нарушений регуляторных процессов нейрогенеза является мутация stambler, при которой структура мозжечка не дезорганизована, но общее число и гранулярных клеток, и клеток Пуркинье уменьшено. В определенный период развития в этих нейронах начинаются нарушения внутренней структуры, которые, однако, затем исчезают.

Приведенные примеры показывают, что метод создания мозаичных особей и метод создания химерных мышей, позволяют исследовать функции генов, реализующих эффекты на стадиях органогенеза.

S.5.5. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В МОЗГЕ

В процессах развития нервной ткани важная роль принадлежит временному режиму экспрессии генов, механизмы которого тесно связаны с процессами межтканевых и межклеточных взаимодействий.

Экспрессия специфических генов в определенные моменты времени определяет, каким будет соотношение медиаторных или гормональных продуктов в конкретный период развития, и как будут формироваться морфологические особенности мозга – его отдельные структуры и связи между ними.

Рассмотрим некоторые особенности формирования медиаторной специфичности гипоталамуса. В одной из первых работ в этой области было показано, например, что в паравентрикулярных и суп-раоптических ядрах гипоталамуса процессинг (т.е. формирование малых пептидных молекул из белков-предшественников с помощью ферментов-протеаз), обеспечивающий "наработку" окситоцина и аргинин-вазопрессина, происходит в разные сроки онтогенеза. В результате этого, начиная с определенного момента развития, нейроны названных ядер имеют четкие нейрохимические различия.

Особенности экспрессии генов в мозге исследуются в настоящее время все более интенсивно. Такие методы позволяют, с одной стороны, оценивать функциональную роль тех или иных воздействий на мозг, точнее, на его генетический аппарат. С другой стороны, нарастает число работ, в которых исследуются изменения экспрессии специфичного для нервной ткани гена при каких-либо воздействиях, например при сенсорной стимуляции, при стрессе, разрушении отделов мозга и т.п. В этом отношении можно уверенно утверждать, что рождается новый методический подход к оценке физиологического состояния мозга, сходный с методом исследования электрофизиологических процессов в нервной ткани. Наиболее полно в этом плане изучены так называемые протоонкогены, или быстрые гены раннего действия, относящиеся к семействам генов c-fos, c-jun и др.

Эти гены кодируют белки, являющиеся так называемыми факторами транскрипции, т.е. молекулами, которые определяют включение в работу отдельных генов и групп генов, или же их репрессию. Не вдаваясь в детали описания этих молекулярных событий, отметим, что гены раннего действия были первоначально описаны как факторы, способствующие или сопутствующие формированию злокачественных новообразований. Позднее было показано, что в нормальных условиях эти гены интенсивно экспрессируются в период эмбрионального и частично постэмбрионального развития. В то же время их экспрессия проявляется через очень короткий промежуток времени после некоторых физиологических, а также патологических воздействий на мозг. Примером может служить повышение экспрессии гена c-fos как реакция на развитие судорожной активности. Поскольку экспрессия этих генов оказывается, видимо, первым событием в каскаде, ведущим к изменению экспрессии генетических элементов в ряде структур мозга, то очевиден большой интерес исследователей к ним (см.: Анохин, Судаков, 1993). У крыс линии КМ, выделенной по высокой чувствительности к звуку (см.: 8.6.5.1), в период после судорожного припадка экспрессия генов этой категории оказывается сниженной.

Иммуногистохимическим методом в ткани мозга крыс выявлены специфические белковые продукты экспрессии ранних генов. Они были найдены в нейронах примерно 100 ядер и областей мозга интактной крысы (c-Jun, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Krox-24). Был составлен своеобразный "атлас" экспрессии соответствующих ранних генов (Herdegen et al, 1995), каждый из которых имел свой "индивидуальный профиль" экспрессии в мозге. Полагают, что активация семейств таких генов определяется разными механизмами и происходит при разных физиологических состояниях мозга и организма в целом.

8.6.

Генетические исследования поведения млекопитающих

Классический менделевский анализ рассматривает признаки, которые находятся под влиянием одного, двух, реже трех генов. Это так называемое моно- или дигенное (олигогенное) наследование. В подобных случаях фенотипы разделяются на небольшое число дискретных классов. К категории "менделирующих" генов относятся, например, гены, влияющие на обмен веществ, а их плейотроп-ные эффекты затрагивают поведение (см.: 8.2.2). Ряд примеров такого наследования особенностей поведения, например уровня двигательной активности, будет приведен в разделе 8.6.4.

В то же время огромное большинство признаков поведения, так называемых количественных, отличаются плавной (недискретной) изменчивостью, которая определяется значительным числом генов. В генетике количественных признаков анализируют состав изменчивости. Ее оценивают путем определения генетической и средовой компонент дисперсии величины признака, а также доли изменчивости, которая связана с эффектами взаимодействия генетических и средовых факторов. Эти методы подробно рассматриваются в специальных руководствах (Рокицкий, 1977; Мазер, Джинкс, 1985 и др.). В применении к генетическим исследованиям поведения примеры таких расчетов и пояснения к ним можно найти в руководстве Эрман и Парсонса (1984).

Ниже рассматриваются основные результаты генетических исследований как олигогенных, так и количественных признаков поведения, а также некоторые данные, которые легли в основу современного понимания роли генотипа в процессах формирования поведения. Кроме того, дается краткое описание основных методов и экспериментальных приемов.