Практична робота студентів

1.Приготувати препарат з харкотиння хворого на туберкульоз.

2.Зафарбувати по Цилю-Нільсену, мікроскопувати, зарисувати.

Алгоритм практичної роботи

Робота 1. Гомогенізоване харкотиння міститься в пробірці. Петлею треба взяти матеріал з дна пробірки, попередньо зтруснувши її для збільшення ймовірності потрапляння мікобактерій в препарат, та нанести на предметне скельце. Приготований препарат зафіксувати та фарбувати по Цилю-Нільсену. Потім препарат переглянути під мікроскопом. Збудники туберкульозу розташовуються поодиноко або (переважно) в безладних сукупченнях. Знайдіть поле зору, в якому є хоча б одне таке сукупчення. Мікобактерії туберкульозу мають вигляд рожевих паличок.

Робота2. Переглянути та замалювати у протокол демонстрацію

Демонстрація

МІКРОСКОПІЧНІ ПРЕПАРАТИ

Мазок з харкотиння хворого на туберкульоз, фарбування по Цилю-Нільсену

Кислотостійкі мікобактерії зафарбовані в червоний колір, розташовуються поодиноко, частіше в безладних скупченнях (у вигляді “клубочків”) на блакитному фоні. В полі зору може бути видна також супутня флора (не кислотостійкі, зафарбовані в синій колір мікроорганізми) та лейкоцити. Мікроскопія мазка з харкотиння виконується в рамках мікроскопічного методу діагностики туберкульозу. Але слід відзначити, що позитивний результат можливий лише при наявності в 1 мл харкотиння не менш як 50 000 мікробних тіл.

Мазок з культури M.tuberculosis, фарбований по Цилю-Нільсену

Препарат схожий з попереднім: також на блакитному фоні ви спостерігаєте дрібні паличкоподібні мікроорганізми червоного кольору. В такому препараті можливо помітити бактерії з нетиповими властивостями (результат фенотипічної мінливості): від шароподібних до розгалужених, можливі кислотоподатливі.

ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА

Середовище Левенштейна-Йенсена використовується для культивування мікобактерій туберкульозу. Складається з дистильованої води, гліцерину, аспарагіну, фосфату калію одно заміщеного, сульфату магнію, цитрату магнію, картопляної муки (крохмалю), малахітового зеленого (отриману суміш стерілізують 15 хвилин при 120° С) і яєчної суміші (з курячих яєць готується стерильно: яйця миють щіткою з милом у проточній воді, а потім кладуть в 70% спирт на термін не менше 1 год.) Стерильне середовище нагрівають до 45-60° С, перемішують, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у пробірки і залишають для згортання в нахиленому положенні при 85 С на 45 хв.

Флакон для збору харкотиння

Сплощений флакон з темного скла з кришкою, що закручується, використовують для того, щоб не забруднити навколишнє середовище навколо хворого надзвичайно стійкими в зовнішньому середовищі туберкульозними мікобактеріями і щоб в досліджуваний матеріал не потрапили кислотостійкі бактерії, що вегетують в зовнішньому середовищі. Флакон має форму, що робить його комфортним під час носіння в кишені чи сумочці. Після того, як флакон заповнений, його разом з харкотинням замочують у дезрозчині для знезараження.

Колба з харкотинням обробленим методом флотації

Для підвищення чутливості мікроскопічного методу діагностики використовують методи “збагачення” (концентрування) мікобактерій. Метод флотації - один з найбільш розповсюджених, який використовують з даною метою.Використовують ерленмейеровську колбу чи пляшку з покатими плечиками, що вміщує 250 мл. У неї вносять 10-15 мл. досліджуваного матеріалу та стільки ж 0,5% розчину їдкого натра чи калію. Якщо матеріал густий, дозволено додавати подвійний об’єм лугу. Колбу закривають щільно гумовою пробкою, обгорнутою вощаним папером. Суміш матеріалу з лугом зтруснути декілька разів до гомогенізації матеріалу, потім додають приблизно 50 мл. свіжоперегнанної дистильованої води і 1 мл. якого-небудь вуглеводу (толуол, ксилол, бензол) , зтрушують і знову додають дистильованної води до половини пляшки. Зтрушують ще 10-15 хвилин. Додають дистильованої води до горличка і лишають стояти при кімнатній температурі 1-2 години. Зважені в суміші рідини мікобактерії прилипають до поверхні пухирців вуглеводів і виносяться ними нагору, де ці пухирці утворюють вершкоподібний шар у вигляді кільця. Це кільце відсмоктують піпеткою з грушею і наносять на предметні скельця. Мазки підсушують, фіксують і фарбують по Цилю-Нільсену.