17

Лекция 1. Введение в вирусологию

История вирусологии довольно необычна. Первая вак­цина для предупреждения вирусной инфекции — оспы была предложена английским врачом Э. Дженнером в 1796 г., почти за сто лет до открытия вирусов, вторая вакцина — антирабическая была предложена основателем микробиологии Л. Пастером в 1885 г.— за семь лет до открытия вирусов.

Вирусология — новая область науки. Слово «вирус» означает яд, оно применялось еще Л. Пастером для обозначения заразного начала и до разработки бактериологических методов все инфек­ционные агенты называли вирусами. Одним из немногих доступ­ных методов изучения причин заразных болезней было введение неочищенных материалов, полученных от больных. Только благо­даря работам Коха, который впервые использовал технику чис­тых (бактериальных культур, появилась возможность выделить бактерии — возбудителей многих инфекционных заболеваний. После того как было установлено, что этиологическими агента­ми инфекционных болезней являются бактерии, стало возмож­ным различать бактериальные и небактериальные заболевания. В, сущности, наиболее ранние описания агентов, которых можно рассматривать как вирусы, появились после развития представ­лений о фильтрующихся возбудителях. Такие возбудители были инфекционны, но их не удавалось идентифицировать с помощью бактериальных методов, доступных в конце XIX «. Их отличи­тельной особенностью являлось то, что они сохраняли инфекционность после прохождения через фильтры, задерживающие бактерии.

Д. И. Ивановский впервые в 1892 г. доказал существование нового типа возбудителя болезней на примере мозаичной болезни табака. В содержимом пораженного листа он не обнаружил бактерий, однако сок больного растения вызывал поражения здоровых листьев. Д. И. Ивановский профильтровал сок больного растения через свечу Шамберлана, поры которой задерживали мельчайшие бактерии. В результате он обнаружил, что воз­будитель проходит даже через такие поры, так как фильт­рат продолжал вызывать заболевание листьев табака. Культивирование его на искусственных питательных сре­дах оказалось невозможным. Д. И. Ивановский приходит к выводу, что возбудитель имеет необычную природу: он фильтруется через бактериальные фильтры и не способен расти на искусственных питательных средах. Он назвал новый тип возбудителя «фильтрующиеся бактерии».

Опыты Д. И. Ивановского в 1898 г. повторил гол­ландский ученый М. В. Бейеринк, придя, однако, к вы­воду, что возбудитель табачной мозаики — жидкий живой контагий. Д. И. Ивановский с этим выводом не согла­сился. К этому времени были опубликованы работы Ф. Леффлера и П. Фроша, показавших, что возбудитель ящура также проходит через бактериальные фильтры. Д. И. Ивановский, анализируя эти данные, пришел к вы воду, что агенты ящура и табачной мозаики принци­пиально сходны. В основе этого открытия лежало Измерение единствен­ной физико-химической характеристики вирусов — фильтруемости. В сущности, это была такая оценка размера вирусов, которая ставила их особняком от «микробов». В то время опре­деление других физико-химических свойств было невозможным, и большинство исследований было направлено на изучение ин­фекционного процесса и реакции на него со стороны организма-хозяина.Поэтому стали применять название «ультравирус» или «фильтрую­щий вирус», затем определение отбросили и укоренился термин «вирус».

В 1917 г. Ф. д'Эррель открыл бактериофаг — вирус, по­ражающий актерии. Та­ким образом, вирусы вызывают болезни растений, живот­ных, бактерий. Открытия вирусов следовали одно за другим: 1897 г. — вирус ящура; 1901 г. — вирус желтой лихорадки; 1903 г. — вирус бешенства; 1908 г. — ви рус оспы человека; 1909 г. — вирус олиомиелита. Эти открытия не прекращаются и в наше время: 1970 г. — вирус гепатита В; 1973 г. — вирус гепатита А; 1977 г. — вирус дельта-гепатита; 1983 г. — вирус иммунодефицита человека.

Чтобы осознать происходящий в XX столетии Прогресс в понимании того, что такое вирусы, следует подробно обсудить методы, используемые в вирусологии с конца XIX в. и до настоящего времени, а также рассмотреть концепции, которые сыграли роль в этом понимании.

История методов и концепций в вирусологии

Системы животного-хозяина

Пастер был первым, кто начал (1881 г.) систематически использовать лабораторных животных в работах по изучению вируса бешенства [22]. Его исследования по инокуляции материала, полученного от больных бешенством, в мозг кролика были провозвестниками более поздних экспериментов, в которых вирусные агенты стали вводить непосредственно в высоко восприимчивый к заболеванию орган или ткань. Другая важная веха на рубеже столетия — это опыты Военной комисоии США по желтой лихорадке, которыми руководил Уолтер Рид [23]. В них было установлено, что вирус желтой лихорадки — первый обнаруженный вирус человека —присутствует в крови больного в течение первых трех дней лихорадки, что вирус может передаваться при укусе комара и что прежде, чем комар приобретает способность передавать инфекцию, должно пройти определенное время. Так появилось представление о внешнем инкубационном периоде. После этого прошло более 30 лет, когда Макс Тейлор, положивший начало современному этапу работ над желтой лихорадкой, усовершенствовал и ввел в систему использование в качестве восприимчивых животных-хозяев мышей [32]. Развитие его подхода в конечном итоге привело к получению других вирусов, причем кульминацией в этом цикле работ стало выделение Далдорфом и Сайклзом в 1948 г. группы вирусов эпидемической миалгии на мышах-сосунках [7]. В начале тридцатых годов кроме мышей стали использовать также куриные эмбрионы, т. е. появился еще один источник тканей, чувствительных к заражению вирусами и способных поддерживать их размножение, особенно подходящий для группы поксвирусов.

По мере того как появлялись и совершенствовались все эти экспериментальные системы, развивались количественные методы исследований. К ним относится тестирование на людях лимфы, содержащей вирус осповакцины, которое начали проводить с 1920 г., а также методы определения других вирусов, разработанные после появления работы Гарви и Актона с вирусом бешенства в 1923 г. [12].

Культура клеток

Развитие вирусологии очень сильно зависело от разработки метода культур клеток, которые сначала появились в конце 20-х годов, а затем в 40-х годах были применены для исследования вирусов энцефалитов. В 1949 г. в ключевом эксперименте Эндерса и др. [11] было показано, что культуры клеток способны поддерживать рост вируса полиомиелита. Это открытие возве­стило о приходе эры современной вирусологии и послужило толчком к ряду исследований, которые в конечном итоге привели к выделению многих вирусов, вызывающих серьезные заболева­ния у человека. Таким образом, 50-е и 60-е годы стали золотым веком медицинской вирусологии. Выделение ряда энтеровирусов (Коксаки, ЕСНО) и респираторных (адено-, респираторно-синци-тального) вирусов привело к тому, что были установлены при­чины большого числа болезней, вирусное происхождение кото­рых до того момента лишь предполагали. Параллельно с этими медицинскими исследованиями после 1952 г., когда Дульбекко применил к вирусам животных метод бляшек (негативных коло­ний) [10], в количественную вирусологию вошли системы культур ткани. Метод бляшек был прямым продолжением исследований, проводившихся на бактериях и бактериофагах.

Бактериальные вирусы и генетика бактерий

В 1917 г. было обнаружено, что бактерии могут заражаться вирусами, т. е. были открыты бактериальные вирусы — бактерио­фаги. Открытие бактериофагии было оценено в конце 30-х годов, когда группа ученых занялась иссле­дованием бактериофагов, используя их как удобную модель для изучения взаимодействий вирус —клетка в точных биохимиче­ских и генетических терминах. Дельбрюк, Луриа и другие ввели количественную методологию и разработали системы для изуче­ния литических взаимодействий бактериофага и клетки, что по­могло уточнить понятие мутации; они развили методы и подхо­ды, позволившие в полной мере определить очень важные гене­тические понятия [8, -20]. Затем Херши и Чейз доказали, что генетическая информация бактериальных вирусов закодирована в их нуклеиновых кислотах [13]. Вслед за этим было установле­но, что вирусы содержат либо РНК, либо ДНК. В процессе ис­следований заражения бактерий бактериофагами были сформу­лированы многие принципы, -на которых основана современная молекулярная биология.

Оказалось, что кроме литических взаимодействий, при которых бактериальные вирусы вызывают ли­зис зараженных бактерий, существует вегетативная вирусная инфекция — понятие, введенное Львовым [21], — при которой фаг входит в бактерию-хозяина, не вызывая лизиса. Это явление ли-зогении, или пассивной инфекции, дало возможность понять, как происходит встраивание вируса в хромосомы хозяина, и тем са­мым представить, как могут встраиваться в хромосомы клетки-хозяина опухолеродные вирусы. Именно применение бактериофагов в качестве генетического инструмента позволило объединить генетику и биохимию в молекулярную биологию. Эти исследования фагов находились в центре той революции в биологии, которая привела к возникновению молекулярной биологии.

Биохимия и молекулярная биология

Исторически сложилось так, что большую часть усилий виру­сологи затратили на идентификацию вирусов различных болез­ней— они изучали патологию болезни и определяли, является ли ее возбудителем вирус. Однако, вирусы растений и животных сыграли важную роль не только в тех областях, где непосредст­венно изучают болезни человека и животных, но и в смежных с ними, например в биохимии.

В 1935 г. был закристаллизован один из вирусов растений — вирус табачной мозаики — и это послужило толчком к тому, что­бы рассматривать вирусы как простой комплекс химических ве­ществ, состоящий из белка и рибонуклеиновой кислоты. Вскоре появились кристаллы других вирусов растений, но пер­вый вирус человека — вирус полиомиелита — закристаллизовали только в 1955 г. И лишь в 80-х годах удалось выяснить тонкие детали, строения некоторых из этих кристаллических структур и от них перейти к объяснению структуры и функций важных вирусных белков. Например, стала возможной кристаллизация индивидуальных вирусных белков, таких как гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа, а также кристаллизация целого интактного вириона — вируса кустистой карликовости томата {гл. 3 и 4). Эти исследования привели к выяснению связи меж­ду биохимическими свойствами отдельных белков и точной фи­зической структурой и функцией целого вириона.

В 60-е годы появился метод центрифугирования в градиенте плотности. С его помощью исследователи научились получать вирусы в чистом виде и идентифицировать их составляющие, что способствовало более подробному изучению путей сборки ви­русной частицы. Гель-электрофорез в полиакриламидном геле позволил разделить белковые смеси. Первоначально это было сделано с вирусом полиомиелита, а затем с более сложными вирусами и культивируемыми клетками. В 60-х и начале 70-х годов был открыт ряд ферментов ви­русов, в том числе РНК-полимераза у вируса осповакцины и РНК.-содержащих вирусов [16]. Самый замечательный фермент был обнаружен у ретровирусов — это обратная транскриптаза (ревертаза), способная синтезировать ДНК на РНК-матрице [1, 31]. И наконец, совсем недавно были обнаружены ферменты, осуществляющие кэппинг мРНК [27].

Электронная микроскопия и ультраструктура

Сложную структуру вируса удалось описать только в 1940 г. [25] благодаря приме­нению электронной микроскопии. Конечно, на ранних стадиях электронно-микроскопических исследований детали ультраструк­туры вирусных частиц установить не удалось. Однако были из­мерены размеры вирусных частиц, которые затем сравнили-с размерами, полученными с помощью фильтрации и других ме­тодов. Несмотря на некоторое расхождение результатов, стало ясно, что самые большие вирусы немногим меньше бактерий, тогда как самые маленькие чрезвычайно малы. Существенным достижением было появление метода негативного контрастиро­вания, который позволил проводить анализ нефиксированных препаратов и неочищенных вирусных суспензий [3]. К этому вре­мени были сформулированы основные принципы сборки виру­сов, а также выяснилось, что вирусные капсиды бывают спи­ральными и икосаэдричеокими [4, 6].

Одна из интересных возможностей электронной микроскопии в этой области исследований была оценена лишь впоследствии, когда удалось применить этот метод для идентификации «кап­ризных» по своим ростовым свойствам вирусов, таких как воз­будители вирусных гастроэнтеритов (ротавирусы и норуокский агент) и гепатита. Кроме того, именно электронная микроскопия сыграла главную роль в идентификации этиологических агентов подострого склерозирующего панэнцефалита и прогрессирующе­го очагового лейкоэнцефалита.

Иммунология

Вирусологи считают одной из своих задач поиск путей пред­отвращения вирусных заболеваний. По мере решения этой за­дачи развивались представления о двух формах иммунитета хозяина — гуморального и клеточного. В начале двадцатого столе­тия методы иммунологии играли важную роль в классификации вирусов и изучении природы противовирусного иммунитета. При этом особо следует отметить три метода. Первый — это гемагглютинация— важный иммунологический метод для быстрой идентификации вирусного агента, открытый Хирстом в 40-е го­ды [14]. С помощью гемагглютинации, или склеивания эритро­цитов, можно производить быструю проверку на присутствие вируса, поверхностные белки которого вызывают агглютинацию эритроцитов. Этот метод сыграл важную роль в изучении виру­сов и в развитии методов их количественного определения. Радиоиммунный анализ, который появился в 60-е годы и сразу же стал мощным инструментом быстрой высокочувстви­тельной идентификации и анализа вирусов иммунологическими средствами. И, наконец, с помощью появившихся в последнее десятилетие моноклональных антител возникла возможность идентифицировать специфические области (эпитопы) вирусных белков; благодаря этому в руках у исследователей оказался чрезвычайно специфический тест на индивидуальные вирусные белки

ПРИРОДА ВИРУСОВ

Со времени открытия вирусов по настоящее время представления о природе вирусов претерпели значительные изменения.

Д. И. Ивановский и другие исследователи того времени подчеркивали два свойства вирусов, позволившие выделить их из общей массы микроорганизмов: фильтруемость и неспособность размножаться на всех искусственных пи­тательных средах. Позже выяснилось, что эти свойства не абсолютны, так как были обнаружены фильтрующиеся (L) формы бактерий и микоплазмы, растущие на искус­ственных питательных средах, по размерам приближаю­щиеся к наиболее крупным вирусам (вирусы оспы чело­века и животных).

Основные свойства вирусов

Основные свойства вирусов, по которым они отличаются от всех остальных жи­вых существ (кроме плазмид — см. с. 127—128), следующие:

1. Ультрамикроскопические размеры. 10-200нм

2. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК, или РНК. Все другие организмы содержат нуклеиновые кислоты обоих типов, а геном у них представлен только ДНК.

3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению. Способ размножения резко отличается от способов раз­множения всех других клеток и организмов (бинарное деление, почкование, образование спор). Вирусы размножаются путем воспроизводства себя из собственной геномной нуклеиновой кислоты. Размножение всех прочих организмов включает стадии би­нарного деления клеток. Вирусы не растут, и их размножение обозначается как дисъюнктивная (разобщенная) репродукция, что подчеркивает разобщен­ность в пространстве (на территории клетки) и времени синтеза вирусных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) с последующей сборкой и формированием вирионов.

4. У вирусов отсутствуют собственные системы мобилизации энергии.

5. У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем. Синтез вирусных белков осуществляется белок-синтезирующим аппаратом клетки — клеточными рибосомами, ко­торые связываются с вирусными иРНК.

В связи с отсутствием собственных систем синтеза белка и мобилизации энер­гии вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. Средой обита­ния вирусов являются бактерии, клетки растений, животных и человека. Внутриклеточный паразитизм вирусов также оказался не абсолютным критерием, отграничивающим их от ос­тальных микроорганизмов. Внутриклеточными паразитами являются не только вирусы, но и некоторые бактерии (го­нококки, менингококки) и простейшие (малярийный плазмодий). Вирусы вводят в клетку лишь свою генетическую информацию, которая успешно конкурирует с клеточной информацией, несмотря на ничтожно малые размеры вирусных геномов (на 5—6 порядков меньших по молекулярным массам, чем геном эукариотической клетки). Поэтому и уровень паразитизма у вирусов иной, чем у бактерий или простейших: в отличие от внутриклеточного паразитизма последних паразитизм вирусов определяется как генетический паразитизм, а ви­русы рассматриваются как генетические паразиты. Ярким примером генетического паразитизма является способность ряда вирусов интегрировать (объединяться) с клеточным геномом. В этом случае вирусные гены превращаются в группу клеточных генов и обозначаются как провирус. Стадия интеграции, помимо умеренных ДНК-содержащих фагов, характерна для онкогенных ДНК-содержащих вирусов и вируса гепатита В. Эта стадия обязательна для большой группы РНК-содержащих вирусов — ретро-вирусов.

Однако и в том случае, когда интеграции не происхо­дит и вирусный геном находится в автономном состоя­нии, возникновение инфекции обусловлено конкуренцией вирусного и клеточного геномов.

С учетом перечисленных особенностей вирусам можно дать следующее определе­ние: вирусы — особое царство улътрамикроскопигеских размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собствен­ных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся поэтому аб­солютными внутриклетогными паразитами (А. И. Коротяев). Положение «вирусы – это вирусы» независит от хозяина.

Существует и другой взгляд на природу вирусов: «...вирусы можно рассматри­вать как генетигеские элементы, одетые в защитную обологку и способные переходить из одной клетки в другую» (Альберт Б. [и др.], 1986). Однако эти же авторы там же называют репродукцию вируса в клетке его жизненным циклом.

В связи с вышеизложенным не раз возникали дискус­сии по поводу того, что же такое вирусы — живое или не живое, организмы или не организмы. Безусловно, вирусы обладают основными свойствами всех других форм жиз­ни — способностью размножаться, наследственностью, изменчивостью, приспособляемостью к условиям внешней среды; они занимают определенную экологическую нишу, на них распространяются законы эволюции органического мира на земле. Поэтому к середине 40-х годов сложи­лось представление о вирусах как о наиболее простых микроорганизмах. Логическим развитием этих взглядов было введение термина «вирион», обозначавшего внекле­точный вирусный индивидуум. Однако с развитием иссле­дований по молекулярной биологии вирусов стали накап­ливаться факты, противоречащие представлению о виру­сах как организмах.

Отсутствие собственных белок-синтезирующих систем, дисъюнктивный способ репродукции, интеграция с клеточ­ным геномом, существование вирусов сателлитов и дефект­ных вирусов, феноменов множественной реактивации и комплементации — все это мало укладывается в представ­ление о вирусах как организмах. Представление это еще более теряет смысл, когда мы обратимся к вирусоподоб­ным структурам — плазмидам, вироидам и агентам типа возбудителя скрепи.

Плазмиды (другие названия — эписомы, эпивирусы) представляют двунитчатые кольцевые ДНК с молекуляр­ной массой в несколько миллионов, реплицируемые клет­кой. Они вначале были обнаружены у прокариотов, и с их существованием связаны разные свойства бактерий, например устойчивость к антибиотикам. Поскольку плаз­миды обычно не связаны с бактериальной хромосомой (хотя многие из них способны к интеграции), их считают экстрахромосомными факторами наследственности.

Плазмиды были обнаружены и у эукариотов (дрожжей и других грибов), более того, обычные вирусы высших животных также могут существовать в виде плазмид, т. е. кольцевых ДНК, лишенных собственных белков и реплицируемых клеточными ферментами синтеза ДНК. В част­ности, в виде плазмид могут существовать вирусы папил­ломы коров, обезьяний вирус 40 (SV40). При персистенции вируса герпеса в культуре клеток могут образовываться плазмиды — кольцевые ДНК, составляющие лишь часть генома этого вируса.

Наконец, следует упомянуть об агенте скрепи — воз­будителе подострой трансмиссивной губкообразной энце­фалопатии овец. Вероятно, сходные агенты вызывают и другие формы губкообразных энцефалопатии животных и человека, в основе которых лежит прогрессирующее разрушение нервных клеток, в результате чего мозг при­обретает губчатую (спонгиоформную) структуру. Агент скрепи имеет белковую природу и даже получил специ­альное название — прион (от слов рго1ешасеош шгесйош; рагйс1е — белковая инфекционная частица). Предполага­ется, что этот белок является одновременно и индуктором и продуктом какого-то клеточного гена, ставшего авто­номным и ускользнувшего от регуляции («взбесившийся ген»).

Все вирусы, включая сателлиты и дефектные вирусы, плазмиды, вироиды и даже агенты скрепи (их гены), име­ют нечто общее, их объединяющее. Все они являются автономными генетическими структурами, способными функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках животных, растений, простейших, грибов, бактерий. По-видимому, это наиболее общее определение, позволяющее очертить царство вирусов. На основании сформулированного определения вирусы, не будучи орга­низмами, тем не менее являются своеобразной формой жизни и поэтому подчиняются законам эволюции орга­нического мира на земле.