Lectures

Monday, February 07, 2005

11:56 AM

 

Лекция 1.

 

1972 - первая рекомбинатная молекула ДНК в стэнфорде. Объединение ДНК E. coli и SV40. возникли терминологические проблемы.

 

Приравнивают понятия генная и генетическая инжененрия. Но генная - манипуляция с конкретными генами (изменения в структурную часть гена, либо замена регуляторных областей). В этом случае реально работают с природными генами, принципиально новых генов не создано.

 

Генная инжененрия - часть генетической, но они не равны.

 

Клеточная инжененрия - первоначально относился к работам по получению клеточных гибридов. Конечная цель этого направления - объединине с одной стороны нескольких геномов путем слияния изолированных клеток, а с другой стороны - объединение не только генетического материала, но и характерных для клеток разных видов клеточных структур.

 

У бактерий нет межвидового барьера между разными "видами". Наличие плазмид гарантирует возможность получать информацию от очень удаленных видов. У эукариот после слияния клеток разных видов нельзя добиться стабилизации геномов. Даже при замене отдельных компонентов (ядра) результатов небыло.

 

Поэтому методы перешли в русло генетической инженерии. То есть клеточная инженерия - часть генетической и ее методического аппарата.

 

Морально-этические проблемы. Сомнения в том плане, что будут ли такие изменения безопасными. В 1977 в лаборатории фирмы Miles провели симпозиум, на котором на каждой секции обсуждали социальные аспекты зарождающегося направления. Инициировали те люди, которые работали в этой области с целью обсуждения правил проведения исследований для того, чтобы это было безопасно. Сначала хотели ограничить работу несколькими лабораториями и наложить мораторий на эти исследования.

 

В начале 70-х исследования таких бактерий, как Агробактерии, показали, что существует природный механизм, обеспечивающий введение генетической информации прокариот в геном эукариот. Исследования велись в США и Бельгии и Голландии. В США Нестер, в Бельгии - Шела-монтегю. Их интересовало, почему поражаемые агробактериями растения изменяются так, что часть их клеток получают способность к неконтролируемому "гормоннезависимому" росту. При получении изолированных клеток и создании культур, нужны были гормоны, но клетки из пораженных агробактериями растений могли образовывать каллусы без гормонов. Считалось, что подобного рода изменения растительных клеток - следствие генетических изменений, которые вызываются контактом растительного организма с патогеном. Искали в клетках последовательности ДНК, несвойственных растению, а свойственную паразиту. Но исследовали при помощи реассоциации ДНК при изменении температуры. Первыми присутствие этих фрагментов показали американцы. Природная трансформация растений бактериями. Продолжили детальное изучение агробактерий для выяснения свойств, обеспечивающих такую трансформацию.

 

Основные заболевания связанные с агробактериями - галлы. Разрастание тканей растений под влиянием какого-либо внешнего фактора. В широком смысле, могут возникать под воздействием животных (нематоды, клещи, насекомые), грибов, вирусов. Изветсны бактерии, контакт которых с растениями вызывает развитие утолщений, но только агробактерии способны давать галлы с неограниченным ростом. У других галлов - прекращают рост при исчезновения паразита, в случае агробактерий - после удаления их из галла, галл продолжает расти - неограниченный рост. Опухоли с неограниченным ростом фиксировались у двудольных, у однодольных - нет. Морфологически известно несколько вариантов галла - корончатый галл. Обычно располагаются у корневой шейки. Еще одна разновидность стеблевой галл - утолщаются боковые побеги, встречаются реже. Агробактерии проникают через поврежденные ткани, нет механизмов инвазии. А нижняя часть растения повреждается больше - при агротехнике, или поврежедния насекомыми. Бородатый корень - главный корень инфицируется и разрастается.

 

Вызывать эти поражения могут бактерии разных видов. Корончатый галл - A. tumefaciens, стеблевой - A. rubi, бородатый корень - A. rhizogenes. Первое описание дали Смит и Таусенд в 1907. описание чистых культур. Показали, что агробактерии вызывают корончатый галл. Снача называли Bacterium tumefaciens, потом pseudomonas t., phytomonas t., Коннели в 30х годах дал современное название.

 

Род А. Относится к семейству rhizobiaceae. Оказалось, что помимо трех патогенных видов есть еще непатогенный вид. A. radiobacter. Клетки до 3 мкм длиной, около 1 мкм шириной (палочки), грам(-), 1-6 жгутики (перитрихи). Аэробы, могут образовывать микрокапсулы, иногда может быть выражена больше (зависит от среды и от поражаемого растения). Могут существовать на мертвых остатках до нескольких лет. Соответственно - необлигатные паразиты. Оптимум 25-30. выше 37 не делятся. По питательным потребностями большинство природных штаммов - прототрофы. При проведении широкого скрининга - штаммы зависимые по витаминам. В отношении хозяйской специфичности - больше всего по tumefaciens, неспециализированы, поражают разные виды растений. 1193 вида анализировали на поражаемость 588 родов из 138 семейств, свыше 60% всех растений могут быть заражены агробактериями. Проблема круга хозяев не только теоретическая, но и важна для сельского хозяйства.

 

Лекция 2.

 

Только поврежденная ткань создает условия для опухоли. Существенно не столько наличие повреждений, а наличие "раневого сока". В 1930 показали, что если смывать раневой сок и после этого наносить агробактерии, то опухоль не развивается. Сведения о том, какие клетки могли быть трансформированы в опухолевые. Оказалось, что разрушенные клетки - питательная среда для агробактерий, размножаясь, они прикрепляются к здоровым, находящимся на границе раневых повреждений. Прикрепляются в определнных местах, в которых формируются новые целлюлозные волокна и откладываются пектиновые вещества. Сайты прикрепления бактерий на клетках моркови - 250 участков на одной клетке.

 

Все это связано с превращением здоровой клетки в опухолевую. Создаются условия для переноса ДНК. В 60х стало известно, что измененные злокачественно растительные клетки не только способны к неограниченному делению, но и выделяют нехарактерные для растений вещества - опины (производные аминокислот). Это свойство сохранялось даже после удаления агробактерий - проявление генетических свойств растительной клетки.

 

Первый из опинов - лизопин, который обнаружили в 1956 году. Структуру описали в 1960. это измененнный лизин n-2-d1-карбоксиэтиллизин. Затем выявили октопин и несоклько его производных, в 1969 выделили нопалин. Стало понятно, что такие измененные аминокислоты не все одинаковы, а присутствие того или иного из опинов коррелирует с морфологией опухоли, а с другой стороны - со штаммами агробактерий, вызвавших эту опухоль. Агропины - типовые для агропинового семейства.

 

Опины были разделены на семейства, но и штаммы агробактерий были классифицированы по этому признаку. Основные работы по опинам были сделаны в Версале в лаборатории Мореля. Они выяснили, что агробактерии способны использовать опины в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. Четко прослеживается корреляция опинов со штаммами. Возможность использования опинов связали со специализированными катаболитными системами.

 

2 Этапа деградации:

• Транспорт в бактериальную клетку

• Гидролиз до исходных аминокислот (гистидин, глутамин, орнитин, лейцин). Агропины могут представлять собой изменные молекулы глутамина, содержащие остатки маннитола (манноин - один из опинов агропиновой группы).

 

Дальше исходные метаболиты - по обычным путям. Все различие между штаммами в генах, гидролизующихопины. Для утилизации эктопина бактерии вырабатывают эктопиноксидазу, для транспорта - соответствующие пермиазы. Было показано, что синтез всех этих молекул индуцибелен. Изначально, без наличия опинов в среде такие белковые молекулы в клетке не выявляются, и только при воздействии опинов происходит синтез. Индукторами могут быть опины из конкретных семейств. То есть любой из членов семейства индуцирует.

 

Понимание того, что агробактерии контактируют с растением, изменяя его генетически и заставляя синтезировать несвойственные вещества, позволило Морелю и Чилтону предположить особый вариант паразитизма - "генетическая колонизация" - паразит не просто использует хозяйские ресурсы, но трансформирует его так, что появляются вещества, утилизируемые паразитом. Это создает селективное преимущество паразитам, поскольку другие бактерии не утилизируют опины. Чтобы специфического питательного вещества вырабатывалось больше, возникает опухоль. Руководствуюясь этими соображениями, выясняли, почему клетки делятся. Это связано с продукцией цитокинов и ауксинов. Потенциально, любая клетка может продуцировать эти вещества, но большинство уже дифференцированных клеток имеют ген синтеза гормонов роста в репрессированном состоянии. Первоначально, предполагали, что агробактерии снимают репрессию с генов растений. Но от это й мысли стали отказываться, даже до того, как знали, что вводистя в геном растительной клетки. Исходили из того, какие цитокины и ауксины находили в опухоли.

 

Рост опухолевых клеток из корончатого галла гормоннезависим (изначально так назывались), но поскольку клетки сами производят этот гормон, то это не совсем точно. Известно было , что и некоторые дугие микроорганизмы при контакте с растениями синтезируют вещества, относимые к гормолнам роста растения (pseudomonas, erwinia). Но в этом случае удаление бактерий из растительной ткани - остановка дальнейшего деления клеток. В этом отличие от агробактериальных опухолей. Штаммы агробактерий тоже продуцировали небольшое количество ИУК, но количества его ниже той нормы, которая нужна для формирования корончатого галла. Эта ИУК необходима для прикрепления - индуцирует образование дополнительных элементов клеточной стенки.

 

То есть была база для поиска трансформирующего фактора, изменяющего растительную клетку. В 1940 Прауне назвал это TIP (Tumor Inducing Principle). Пытались биохимически определить вещества, претендовавшие на роль этого фактора. Искали вирусы, которые могли бы поражать клетки, высказывалась мысль, что вирусы бактерий могут поражать эукариотические клетки. Только в конце 60-70х годах, когда появились эффективные методы выявления плазмидных ДНК, удалось показать, что главное отличие вирулентных вариантов от невирулентных заключается в наличии плазмид первые сведения были получены не при прямом поиске плазмидной ДНК. Керр обнаружил, если поместить невирулентную агробактерию в опухоль, в которой есть вирулентные бактерии, то то A. radiobacter приобретает вирулентность (1969). В 1971 Гамильтон и Фолл показали, что можно лишить высоковирулентные штаммы A. tumefaciens онкогенности культивируя при непермиссивных температурах, при которых элиминируется плазмидная ДНК. В тех лабораториях, где работали с агробактериях сразу же провели анализ имеющихся штаммов на наличие плазмид и поддтвердили зависимую от температуры элиминацию, а также описали наличие плазмиды. Приоритет за бельгийцами 1972 - обнаружили плазмидную ДНК в вирулентных штаммах, которой небыло в вирулентных. В 1973 показали, что молекулярная масса плазмид из разных штаммов 113-156МДа. На симпозиуме в 1973 в бельгии эти плазмиды Ti. Фактически, был найден опухоль-индуцирующий фактор.

 

Получение мутации в генах плазмидной ДНК, подтвердило, что это действительно опухольиндуцирующий фактор. Дальнейшие усилия направлены на то, чтобы узнать о плазмидах побольше. Исследование плазмид и поиск плазмидной ДНК в клетках опухолей шли параллельно. В клетках опухолей их не обнаружили. Нестер высказал мысль, что это могут быть фрагменты плазмиды. Проводили исследования по поиску участков плазмид в клетках растений. Применили метод реассоциации НК. ДНК из опухолевых клеток и обычных клеток подвергали плавлению и затем проводилась ренатурация двунитевых молекул в присутствии плазмидной ДНК. При этом была рассчитана скорость ренатурации обычной растительной ДНК, и предполагали, что если комплементарные участки есть в бактериальной ДНК, то скорость ренатурации будет выше. Использовали меченые фосфором ДНК Ti B6-806. ДНК из нормальных тканей табака, ДНК из опухоли табака, индуцированной этим штаммом. Параллельно сравнивали, добавляя ДНК лосося. Сравнение скорости реассоциации показало, что присутствие ДНК из опухолевых клеток регистрируется увеличение скорости образования двунитевых молекул. Это превышение было небольшим, предположили, что не вся плазмидная ДНК комплементарна ДНК опухолевых клеток. Провели подобные эксперименты с рестриктами плазмиды (Sma1) - 19 фрагментов. Фрагменты разлделялись электрофорезом, и с каждым проводили реассоциацию. Оказалось, что в двух фрагментах Sma 1 есть участки, которые могут взаимодействовать с ДНК опухолевых клеток. Затем эти 2 фрагмента рестрицировались дополнительно, с более мелкими фрагментами показали увеличение скорости реассоциации с одним из них. Так впервые открыта Т-ДНК (переносимая ДНК). В этой работе были данные о приблизительном количестве копий в расчете на 1 диплоидный геном, насчитали 18 копий в табачных хромосомах на диплоидный набор.

 

Когда применили гибридизацию по Саузерну (известна с 1975), быстро поддтвердили наличие фрагментов плазмид. Комплементарность проявляется тогда, когда опухали индуцированы тем же штаммом, откуда брали плазмиду.

 

В конце 70х годов, когда проводили скрининг агробактерий, несущих плазмиды. Анализировали природные растения, культуры опухолевых клеток, индуцированные опухоли. Раньше считали, что некоторые опухолевые культуры возникают спонтанно. Оказалось, что ряд этих культур были индуцированы агробактериями.

 

Все основные онкогенные свойства агробактерий можно привязывать к плазмидами. Вся дальнейшая классификация - классификация плазмид, обнаруженных в этих штаммах. Первая классификация была сделана по типу опинов. Названия групп соответствовали названию опинов - эктопиновые, агропиновые и нопалиновые плазмиды. Соотнесли определнные характеристики с морфологией опухоли. Оснонвые различия между опухолями:

• Опухоли могут быть круглыми, шероховатыми неорганизованные вздутия, на поверхности - зачатки придаточных корней. Такие опухоли называют шероховатыми

• Гладкие нет выростов на поверхности, если они появляются, то это зачатки листьев

• Тератомы в этом случае опухоль - беспорядочное скопление тканей, характерных для стеблей, корней и листьев.

 

Плазмиды октопинового типа - шероховатые опухоли. Октопин, лизопин, гистопин, октопиновая кислота. В каждой опухоли - один тип.

Нопалиновые - гладкие опухоли и изредка тератомы. Нопалин, нопалиновая кислота (орнитолин).

Агропиновые трудно отнести к шероховатым или гладким, больше похожи не тератомы, но без зачатков придаточных корней, еще одна особенность - проявление некротизации центральной части опухоли после 2-3 недель.

 

Позже классификацию дополнили - открыли агроцинопины четырех разновидностей (A, B, C, D). Оказалось, что они могут дополнительно присутствовать в опухолях того или иного типа (например, нопалиновые опухоли содержат агроцинопин А и В, агропиновые - содержат C и D).

 

Параллельно с работами по изучению плазмид A. tumefaciens, изучали A. rhizogenes. Те же особенности - нашли плазмиды Ri. Обнаружили агропиновый тип - в опухолях агропины и агроцинопин А, второй тип маннопиновый - в опухолях маннопин, маннопиновая кислота и агропиновая кислота (отличается от агропина), агроцинопин С.

 

В это время уже была классификация по несовместимости.

 

Лекция 3.

 

Агробактериальные плазмиды не очень поддерживаются в E.coli. Первую классификацию по несовместимости сделали в клетках агробактерий. Для осуществления агробактериальной конъюгации необходимы опины. Поэтому на питательных средах не сразу удалось это сделать.