36

ВВЕДЕНИЕ

Широко распространенный термин “кишечные инфекции” относится к большой группе инфекционных заболеваний с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и соответствующей симптоматикой (диарея, боли в области живота, в подложечной области, тошнота, иногда рвота, в тяжелых случаях – выраженная интоксикация, обезвоживание) (Падейская Е.Н.,1997). Этиологическая структура возбудителей инфекционных процессов в последнее десятилетие изменилась: значительно увеличился удельный вес заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами и некоторыми другими видами микроорганизмов, роль которых в инфекционной патологии ранее была неизвестна (Исаков Ю.Ф., 1985).

Инфекционные диареи различного генеза широко распространены в разных регионах мира, могут протекать в тяжелой форме с выраженной токсинемией, в развивающихся странах остаются одной из основных причин заболеваемости и смертности (Покровский и др., 1994).

Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий (Семина и др., 2004).

Выбор препарата и схемы его назначения (дозы, длительность курса) в качестве монотерапии или в комбинации с другими антимикробными средствами должны рассматриваться в зависимости от нозологической формы заболевания с учетом сроков начала лечения, стадии болезни, тяжести процесса, возможности развития осложнений и формирования бактерионосительства. Кишечные инфекции могут осложнять то или иное инфекционное или неинфекционное заболевание.

Цель работы: выделение и идентификация возбудителей острых кишечных инфекций, а также определение чувствительности к антибиотикам выделенных энтеробактерий кишечной группы.

1 Обзор литературы

1.1 Клиническое значение бактерий семейства Enterobacteriaceae

Кишечные инфекции возникают часто и имеют существенное значение в качестве причины смерти, как у детей, так и у взрослых.

Возбудителями этих инфекций могут быть различные бактерии, наиболее важное значение среди них занимают бактерии из семейства Enterobacteriaceae (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, иерсинии, а также клебсиелы).

Общим для этой группы инфекций является орально-фекальный путь заражения (через пищу, воду, контактно-бытовым путем – “болезни грязных рук”), входные ворота инфекции – ЖКТ, основные формы заболевания – гастроэнтерит, энтероколит, колит, гастроэнтероколит или гастрит. При тяжелых формах инфекции (в том числе на фоне иммунодефицитных состояний) могут иметь место токсинемия или бактериемия, реже – септицемия или септикопиемия. (Рахманова и др., 1995). Разнообразие клинических форм кишечных инфекций, вызываемых некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae представлено в таблице 1.

Таблица 1

Возбудители и клинические формы кишечных инфекций (Падейская Е.Н.,1997)

Salmonella typhi, S. paratyphi А и В	Брюшной тиф Паратифы А и В	Острое инфекционное заболевание с циклическим течением; поражение ЖКТ, воспалительный процесс в лимфатическом аппарате кишечника (до некроза), бактериемия, интоксикация. Бактерионосительство.
Salmonella spp., чаще – S. typhimurium, S. enteritidis, S. heidelberg, S. panama Shigella spp.: S. dysenteria, S. flexneri, S. sonnei	Сальмонеллез Шигеллез	Гастроэнтерит, колит; реже – генерализованная инфекция. Бактерионосительство. Поражение дистального отдела толстой кишки (колитическая форма); возможны гастроэнтероколит, общая интоксикация, редко – бактериемия
Escherichia coli – токсигенные, энтеропатогенные штаммы	Эшерихиоз	Интоксикация, поражение ЖКТ (слизистой толстой кишки), иногда “холероподобный эшерихиоз”, возможен геморрагический колит с гемолитической уремией

Кишечные инфекции у человека могут вызывать только представители родов Shigella, Escherichia, Salmonella.

1.1.1 Шигеллезы

Дизентерия (шигеллезы) — острое инфекционное заболевание, характеризующееся синдромом общей интоксикации и поражением желудочно-кишечного тракта. Вызывается различными родами шигелл. (Никифоров и др., 2000). В состав рода Shigella входит 4 вида бактерий: шигеллы дизентерии, Флекснера, Бойда и Зонне. Всего насчитывается около 40 различных сероваров шигелл. Наиболее вирулентной считается шигелла Григорьева-Шига.

Эпидемиология дизентерии. Заболевание относится к типичным кишечным инфекциям с фекально-оральным механизмом передачи. Единственным источником инфекции является больной человек. (Бочков и др., 2001). Заболевание возникает спорадически или приобретает эпидемический характер, когда большую роль в распространении инфекции играют пищевые продукты (чаще — шигеллы Зонне) и вода (чаще — шигеллы Флекснера).

Клиника дизентерии. Инкубационный период составляет 2-4 дня. Заболевание развивается остро. Повышается температура тела, которая у большинства больных держится 2-3 дня. Беспокоят слабость, недомогание, головная боль, озноб, снижение аппетита. У больных возникают боли в животе, носящие схваткообразный характер. Боли могу быть разлитыми, но чаще локализуются в левой подвздошной области. Появляется жидкий стул со слизью и прожилками крови. Стул становится скудным, приобретая типичный дизентерийный характер в виде ректального плевка.

Классификация дизентерий:

• Голитическая форма.

• Гастроэнтероколитическая форма.

• Стертая форма.

• Субклиническая форма.

• Бактерионосительство (реконвалесцентное, транзиторное).

Кроме того, различают острую и хроническую форму. Хроническая дизентерия может протекать в двух вариантах — непрерывном и рецидивирующем.

1.1.2 Эшерихиозы

Эшерихиозы (коли-инфекции) – острые инфекционные заболевания с фекально-оральным механизмом передачи; характерно преимущественное поражение ЖКТ с развитием энтерита или энтероколита, в редких случаях–генерализованных форм с внекишечными проявлениями (Чистенко и др., 2005).

В настоящее время известно около 170 антигенных вариантов Е. coli; более 80 из них вызывают коли-инфекцию. Диареегенные серовары кишечной палочки разделяют на 5 групп:

-энтеропатогенные (ЭПКП);

-энтеротоксигенные (ЭТКП);

-энтероинвазивные (ЭИКП);

-энтерогеморрагические (ЭГКП);

-энтероадгезивные (ЭАКП).

Эпидемиология эшерихиозов. Резервуар и источник инфекции – человек, больной или носитель. Большую эпидемическую опасность представляют больные; среди них наиболее опасны больные эшерихиозами, вызванными ЭПКП и ЭИКП, менее – больные эшерихиозами, обусловленными ЭТКП, ЭГКП и ЭАКП. Механизм передачи – фекально-оральный, пути передачи – пищевой, водный и бытовой.

Патогенез эшерихиозов. Механизмы развития заболеваний зависят от принадлежности диареегенных эшерихий к конкретным группам.

Энтеропатогенные эшерихии – это главным образом вызывают заболевание у детей раннего возраста с поражением преимущественно тонкой кишки. (Носов, 1972). Патогенез поражений обусловлен адгезией бактерий к эпителию кишечника и повреждением микроворсинок, но не инвазией в клетки.

Энтеготоксигенные эшерихии – основные возбудители «диареи путешественников» и детской диареи в странах Третьего мира. Факторами патогенности являются пили-, или фимбриальные, факторы, облегчающие адгезию к эпителию и способствующие колонизации нижних отделов тонкой кишки, а также определяющие способность к токсинообразованию. Выделяют термолабильный, термостабильный энтеротоксин. Эффект высокомолекулярного термолабильного токсина аналогичен действию токсина холерного вибриона [активация аденилатциклазной системы с образованием циклического аденозин 3',5'-монофосфата (цАМФ) и циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)]. Эти возбудители часто становятся этиологическим фактором секреторной диареи у взрослых и детей.

Энтероинвазивные эшерихии могут проникать и размножаться в клетках эпителия кишечника. Они неподвижны и часто не способны ферментировать лактозу (Борисов и др., 1994). Повреждение эпителия способствует увеличению всасывания в кровь эндотоксина бактерий.

Энтерогеморрагические эшерихии, проникая в кровь, усиливают токсическое действие ЛПС-комплекса, что может приводить к развитию гемолитико-уремического синдрома и полиорганной недостаточности (ДВС-синдрому, ИТШ, поражению эндотелия сосудов в клубочках почек и ОПН) (Егорова и др., 2001).

Энтероадгезивные эшерихии не образуют цитотоксины, не инвазируют клетки эпителия, не имеют плазмидный фактор адгезии, могут агрегироваться на поверхности клеточных слоёв. Группа энтероадгезивных эшерихий остаётся наиболее плохо изученной (Покровский и др., 1999).

1.1.3 Сальмонеллёзы

Сальмонеллёз относится к группе острых заболеваний, как людей, так и животных, возбудителями которых являются бактерии рода сальмонелл. Заболевания распространены повсеместно, природный резервуар большинства возбудителей – человек и различные животные. Основные пути передачи – водный и пищевой, реже – контактный путь передачи возбудителя (Никифоров и др., 2000).

Основные заболевания, вызываемые сальмонеллами, можно условно разделить на 3 группы: брюшной тиф и паратифы, гастроэнтериты, септицемии (Митрохин, 2005).

У сальмонелл адгезию к клеткам эпителия обеспечивают пили 1-го (манноза-чувствительные), 3-го и 4-го типов. Сальмонеллы не способны самостоятельно проникать в эпителиальные клетки ЖКТ, а попадают в них посредством эндоцитоза. Бактерии мало приспособлены к размножению в эпителии и, достигая базальной мембраны, попадают в соединительно-тканную собственную пластинку (lamina propria), в брыжеечные лимфатические узлы, откуда они проникают в кровоток. Однако большинство сальмонелл не вызывают клинических проявлений бактериемии, т.к. быстро элиминируется фагоцитами. Исключения – S.typhimurium и S.enterica, способные вызывать септицемии.

Возбудители размножаются в lamina propria, вызывают развитие местной воспалительной реакции и приток жидкости в очаг поражения, а также вырабатывают энтеротоксины, повышающие уровень цАМФ, активирующие синтез простогландинов или нарушающие синтез белка. В отличие от прочих сальмонелл, возбудители брюшного тифа и паратифов, проникнув в кровоток, способны выживать и размножаться в фагоцитах, а после гибели последних в больших количествах высвобождаться в кровь. При этом антиген вирулентности (Vi-Аг) ингибирует действие сывороточных и фагоцитарных бактерицидных факторов. Погибшие сальмонеллы высвобождают эндотоксин, который угнетает деятельность ЦНС. Бактериемия приводит к генерализованному инфицированию различных органов и вторичной инвазии эпителия кишечника (Покровский и др., 1999).

1.2 Идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae

Забор проб и доставка проб в лабораторию производится, согласно Международному стандарту ISO/FDIS15189 с соблюдением следующих правил: в пределах времени, соответствующем природе запрашиваемого исследования; в рамках температурного интервала, указанного в руководстве по взятию первичной пробы и предназначенной для обеспечения сохранности пробы; способом, который обеспечивает безопасность лаборатории.

Для забора проб и обеспечения сохранности пробы используют специальную посуду (табл.2).

Таблица 2

Посуда, используемая для доставки проб в лабораторию (Савицкая и др., 2005)

Источник и вид клинического материала	Изделия, используемые для доставки пробы
Ректальный мазок	Одноразовый стерильный зонд-тампон, вмонтированный в стерильную сухую пробирку (тубсер); или стерильная пробирка со специальной транспортировочной средой; зонд-тампон из нержавеющего материала, вмонтированный в целлюлозную или ватно-марлевую пробку стерильной стеклянной пробирки
Фекалии на наличие кишечных инфекций	Стерильная пробирка с тампоном в физиологическом растворе с глицерином; контейнер транспортировочный со средой для анаэробов в фекальных образцах; зонд-тампон в сухой стерильной одноразовой пробирке (тубсер); стерильная стеклянная пробирка, смонтированная с зондом-тампоном на металлической проволоке из титана, стали, алюминия.

При выделении из клинических образцов принадлежность к семейству Enterobacteriaceae обычно устанавливают по основным морфологическим признакам и наличию (или отсутствию) определённых ферментов, обеспечивающих метаболизм бактерий (Покровский и др., 1999). Морфологические свойства изучаются путем бактериоскопии диагностического материала и мазков из колоний, выросших на плотных и жидких питательных средах культур. Мазки на предметных стеклах фиксируют на пламени горелки или в жидких фиксаторах, окрашивают по Граму. Бактериоскопическое исследование является ориентировочным. Дальнейшее исследование включает посев материала на питательные среды, выделение чистых культур, их идентификацию и определение лекарственной чувствительности. Культуральные свойства изучают при просмотре выросших культур на плотных и жидких питательных средах. На плотных средах учитывают размер колоний, цвет, прозрачность, форму, наличие пигмента, гемолиз вокруг колонии и его характер и т.д. На жидких средах отмечают их прозрачность, наличие осадка (придонный рост) или пленки на поверхности среды (Калюк, 1991).

Исследование биохимических свойств основывается на определении ферментативной сахаролитической активности, способности утилизировать питательные вещества в аэробных и анаэробных условиях культивирования. Антигенные свойства культур изучаются при взаимодействии бактерий и их антигенов с соответствующими антисыворотками (реакции агглютинации, иммунофлюоресценции и др.). После изучения морфологических и культуральных свойств осуществляют постановку дифференциальных тестов с чистыми культурами микроорганизмов (Калюк, 1991).

К семейству Enterobacteriaceae относятся грамнегативные палочки, хорошо растущие на обычных питательных средах, подвижные или неподвижные, расщепляющие глюкозу путем ферментации, не имеющие цитохромоксидазы, редуцирующие нитраты в нитриты. После установления принадлежности штамма к Enterobacteriaceae определяют внутри семейства другие таксономические свойства. При этом основное значение имеет изучение ферментативной характеристики культур. Биохимические признаки кишечных бактерий в пределах рода непостоянны. Поэтому при идентификации используют ряд биохимических тестов, а также изучают аминокислотный метаболизм. Дифференциация проводится до определения рода микроорганизма. Принадлежность микроба к одному из родов семейства Enterobacteriaceae устанавливается по ряду биохимических тестов. Изучают подвижность, ферментацию глюкозы, лактозы, маннита, разложение мочевины, усвоение цитрата, разжижение желатины, образование индола и сероводорода, утилизацию малоната, дезаминирование фенилаланина, декарбоксилирование лизина. В таблице 3 представлены основные признаки межродовой дифференциации семейства Enterobacteriaceae. Полная идентификация до рода включает до 25 биохимических тестов (Калюк, 1991). В таблице 4 показаны основные признаки внутриродовой дифференциации некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae.

Таблица 3

Основные признаки межродовой дифференциации семейства Enterobacteriacea

	Тест или  субстрат	Esсherichia	Shigella	Salmonella
По результа- там   посева на  комбини- рованную    среду  (Оль- кеницкого   или сходную)	Лактоза	+,-	-	-
	Глюкоза (газ)	+,-	-	+,-
	Сероводород	-	-	+,-
	Мочевина  (ориентир)	-	-	-
Дополнитель- ные    тесты для  опреде- ления  родо- вой  принад- лежности	Цитрат Симмонса	-	-	+,-
	Мочевина    (по Кристенсену или Преусу)	-	-	-
	Индол	+,-	+,-	-
	Тест  с метило- вым красным	+	+	+
	Тест    Фогеса- Проскауэра	-	-	-
	Фенилаланинде- заминаза	-	-	-
	Лизиндекарбок- силаза	+,-	-	+,-
	Подвижность	+,-	-	+
	Ацетат	+ (+)	-	х

+ – 90% и более положительных реакций.

(+) – Замедленно положительные реакции (через двое и более суток).

- – 90% и более отрицательных реакций.

+,- – чаще положительные, реже отрицательные реакции.

х – различные биохимические реакции.

Таблица 4

Основные признаки внутриродовой дифференциации некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae

Тест или субстрат	Shigella				Salmonella
	dysent.	flexner.	boydii	sonnei	подроды
					I	II	III	IV
Дульцит					+	+	-	-
Маннит	-	+	+	+
Салицин	-	-	-	-	-	-	-	-
Сорбит	х	х	х	-
Сахароза	-	-	-	(+)
Малонат					-	+	+	-
Желатин					-	(+)	(+)	(+)
Орнитин-декарбоксилаза	-	-	-	+
Лактоза	-	-	-	(+)	-	-	+,х	-
Глюкоза (газ)	-	-,+	-	-
Индол				-
Лизин-декарбоксилаза	-	-	-	-

После определения родовой принадлежности бактерий, изучают их лекарственную чувствительность.