- •К практическому занятию n 8. 4 курс 1 семестр тема: «исследование продуктов пол и показателей антиоксидантной системы защиты. Определение малонового диальдегида, активности каталазы, кдз»
- •План самостоятельной работы на занятии
- •Клинико-диагностическое значение.
- •Определение активности каталазы эритроцитов крови
- •Ход определения.
- •Клинико-диагностическое значение.
- •План самостоятельной работы на занятии
- •Методические указания к выполнению самостоятельной работы
- •Сдайте рабочие места дежурным студентам и лаборанту.
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
К практическому занятию n 8. 4 курс 1 семестр тема: «исследование продуктов пол и показателей антиоксидантной системы защиты. Определение малонового диальдегида, активности каталазы, кдз»
МЕСТО ПРОВЕДЕНИЯ: 26 кабинет. ВРЕМЯ ЗАНЯТИЯ: 180 минут.
В соответствии с Государственным образовательным стандартом после изучения раздела «Обмен липидов в норме и патологии» медицинский лабораторный техник должен уметь:
проводить исследование продуктов ПОЛ;
проводить исследование показателей антиоксидантной системы защиты организма;
интерпретировать полученные результаты исследования;
заполнять бланк анализа.
должен знать:
образование, химический состав, обмен транспортных форм липидов: ХМ, ЛОНП, ЛНП, ЛВП;
сущность ПОЛ, его значение;
пути нарушения обмена липидов − нарушение переваривания и всасывания, нарушения
ПОЛ,жировая дегенерация печени, гиперлипопротеинемии.
ЦЕЛИ: 1. Подготовиться к формированию умения оценки ПОЛ и антиоксидантной защиты.
2. Систематизировать знания о механизмах и значении ПОЛ и антиоксидантной защиты.
3. Повторить технику безопасности при работе в биохимической лаборатории;
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
1. Понятие и сущность перекисного окисления липидов.
2. Механизм ПОЛ, роль в организме. Нарушения ПОЛ.
3. Активные формы кислорода, механизм их образования. Роль цитохрома Р450 в их
образовании.
4. Антиоксидантные системы организма: неферментативные и ферментативные. Механизмы их
функционирования.
5. Витамины Е, А, РР, аскорбиновая кислота. Роль в организме и механизм антиоксидантного
их действия.
6. Конечные продукты ПОЛ, влияние на организм.
7. Действие каталазы. Принцип определения, ход определения, клинико-диагностическое
значение определения активности каталазы эритроцитов.
8. Принцип определения, ход определения, клинико-диагностическое значение определения
содержания малонового ангидрида.
9. Характеристика жирных кислот. Пути распада жирных кислот в организме.
План самостоятельной работы на занятии
Подготовка реактивов.
Составление схем исследований.
Определение малонового диальдегида.
Определение активности катадазы эритроцитов крови.
Оформление бланков анализов.
Трактовка результатов.
Приведение в порядок рабочих мест.
ПОСЛЕ ЗАНЯТИЯ СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
проводить исследование продуктов ПОЛ;
проводить исследование показателей антиоксидантной системы защиты организма;
интерпретировать полученные результаты исследования;
заполнять бланк анализа.
ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ
1. В.К. Кухта. Основы биохимии. М. 1999.
2. Методическое пособие к занятию ( взять у лаборанта, переписать).
3. Материалы лекции.
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ К ЗАНЯТИЮ ПО ОСНОВАМ БИОХИМИИ С МЕТОДАМИ КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ №8.
ТЕМА: «ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПОЛ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ. КДЗ»
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГИДА (ТБК- АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ) В ЭРИТРОЦИТАХ КРОВИ
Малоновый диальдегид является конечным продуктом перекисного окисления, которое индуцируется высокореактивными свободными радикалами: супероксидионом, гидроксидионом, атомарным кислородом, синглетным кислородом. Перекисному окислению в большей степени подвергаются липиды, в меньшей степени белки, НК. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является свободно-радикальным процессом, инициация которого происходит при образовании активных форм кислорода — супероксид иона О2*; гидроксильного радикала НО*; гидропероксидного радикала НО2*; -O2 — синглетного кислорода; гипохлоритного иона CLO-.
Основными субстратами ПОЛ являются полиненасыщенные высшие жирные кислоты (ВЖК), находящиеся в структуре фосфолипидов мембран. На разных стадиях пероксидации ВЖК образуются диеновые и триеновые конъюгаты, пероксиды ВЖК (R-OO*), гидроперекиси ВЖК (R-OOH), эндоперекиси, малоновый диальдегид и новые свободные радикалы. Сильнейшим катализатором процесса являются ионы металлов (Fe2+). Процесс обрывается при образовании продуктов, не содержащих свободных радикалов.
ПОЛ — это физиологический процесс, который имеет важное значение для организма, так как регулирует проницаемость мембран, влияет на деление и рост клеток, начинает фагоцитоз, является путем биосинтеза некоторых биологически активных веществ (простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов).
Контроль за физиологическим уровнем ПОЛ осуществляет мощная антиоксидантная система, включающая неферментные антиоксиданты (токоферол, аскорбиновая кислота, Р-каротин, мочевая кислота, убихинон), а также анти-оксидантные ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, церулоплазмин). Антиоксиданты способны прекращать ПОЛ или нейтрализовать продукты ПОЛ. Снижение активности антиокси-дантов или высокая активность прооксидантов (эндо- или экзогенных) могут привести к неконтролируемому ПОЛ, повреждению клеточных структур и гибели клетки.
Интенсификация ПОЛ приводит к развитию многих патологических процессов: последствий радиационных поражений, осложнений при гипероксигенации и гипоксии, опухолей. Пероксидация ЛНП являет-ся одной из причин развития атеросклероза. Образование активных форм кислорода (АФК) идет в реакциях в присутствии оксидаз:
оксидаза
1 ) О2 + е О2- (супероксидион);
2 ) О2- + е О2-2 (пероксидион (Н2О2);
3 ) О2- + Н2О2 О2 + ОН- + ОН' (свободный гидроксильный радикал);
4 ) ОН' + О2 -> ОН- + 1О2 (синглетный кислород)
Реакция 2 и 3 теперь могут повторяться без АФК, они делаются цепными реакциями.
В физиологических условиях ПОЛ обеспечивает быстрое изменение структуры и свойств мембран клеток и цитотоксические реакции при фагоцитозе. В обычных условиях интенсивность ПОЛ незначительна, так как ограничивается антиоксидантной системой (супероксиддисмутаза, каталаза, витамины А, Е, С, РР, рибофлавин, цистеин, метионин, мочевина, селен, цинк, марганец, медь и углекислый газ).
При уменьшении поступления с пищей антиоксидантов, стрессе, тяжёлой физической нагрузке, гипоксии, курении, облучениях и с возрастом ПОЛ усиливается. Это приводит к нарушению целостности мембран клеток, нарушению их транспортной функции и другим нарушениям, в частности является пусковым механизмом атеросклероза.
Принцип метода: основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой.
Реактивы. 1. ТХУ - 170 г/л.
2. Тиобарбитуровая кислота (ТБК) - 8 г/л.
3. Хлорид натрия, изотонический, 0,15 моль/л (9 г/л).
4. Трилон Б (ЭДТА) -1%.
Ход определения.
Кровь отбирают в комплексонат калия (трилон Б), 1 мл несвертываемой крови центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Плазму сливают или отсасывают пипеткой Пастера. К эритроцитам добавляют 3 мл охлажденного физиологического раствора, смесь осторожно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют. Так повторяют трижды. Для исследования отбирают 0,1мл эритроцитов, трижды отмытых охлажденным изотоническим раствором.
Их гемолизируют внесением в пробирку 2,0 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляют 1,0 мл раствора ТХУ и 1,0 мл раствора ТБК.
Пробу прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мини и измеряют интенсивность окраски при длине волны 540 нм (желательно на спектрофотометре) в кювете с толщиной слоя 1 см.
Расчёт по формуле:
Аоп • 106 • 4 (мл)
С (мкмоль/л) = 1,56 • 105 • 0,1 (мл); ,
Где: 4 мл - объем водной фазы,
0,1 мл - объем эритроцитарной массы,
106 - коэффициент перевода «моль/л» в «мкмоль/л»,
1,56 • 105 - коэффициент молярной экстинкции.
Нормальные значения: 0,12 -0,23 мкмоль/л.