- •Глава1.
- •Частьii.Собственныеисследования
- •Глава2. Материалыиметоды…………………………………………502.1.Общаяхарактеристикабольных……………………………………………50
- •Глава3.Результатыисследования………………………………...74
- •Глава4.Обсуждениеполученныхрезультатов…………. 221
- •Списоксокращений
- •Введение Актуальностьпроблемы
- •Научнаяновизнаисследования
- •Практическаязначимость
- •Основныеположения,выносимыеназащиту
- •Внедрениерезультатов работывпрактическоездравоохранение
- •Апробацияработы
- •ГлаваI обзорлитературы
- •ЭтиологияипатогенезИап
- •Классификация,клиническиеособенности иап
- •Пузырчаткавульгарная(Pemphigusvulgaris)
- •Пузырчаткалистовидная(эксфолиативная) /Pemphigusfoliaceus/
- •Паранеопластическаяпузырчатка(Paraneoplasticpemphigus)
- •1.5.1Общиепредставленияомолекулярной фармакологииСгк
- •СтроениеГр:
- •ИзоформыГр:
- •ЛечениебольныхИап
- •АдьювантнаятерапиябольныхИап
- •Азатиоприн
- •ЦиклоспоринA
- •Метотрексат
- •МофетилМикофенолат
- •Циклофосфамид
- •Никотинамидитетрациклин
- •Соли золота
- •Внутривенный иммуноглобулин
- •Пиридостигминабромид
- •Стероиднаярезистентность
- •Механизмы стероидной резистентности на рецепторномуровне
- •Механизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровне
- •ЧастьIi.Собственныеисследования
- •Глава2.Материалыиметодыисследования
- •Общаяхарактеристикабольных
- •Характеристика больных иап, находившихся поднепосредственнымнаблюдением
- •ИзучениекатамнестическихданныхбольныхИап
- •2.1.3. Изучение клинических данных больных для определениямолекулярныхмеханизмовстероиднойрезистентности
- •МужчиныЖенщины
- •В%соотношении
- •Оборудование
- •Изучениехарактерасвязываниясмембраннымирецепторамипо
- •Исследование связывания меченого сгк внутриклеточными
- •Полимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени
- •Описаниеметода:
- •Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне
- •Реактивы
- •Оборудование
- •Приготовлениереактивов
- •Полимеразно-цепнаяреакция
- •Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)
- •Радиоизотопныйметод
- •Постановкарадиоизотопногометода
- •Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия
- •Статистическаяобработкарезультатовисследования
- •Глава3.Результатыисследования
- •Ретроспективный анализисторийболезнибольныхИап
- •Общая характеристикаклиническихданныхбольныхИап
- •Количествобольныхв%соотношении
- •% Отр. 52 Положит. 48 46
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •Нетадювантнойтерапии
- •Такимобразом:
- •3.1.2. ХарактеристикастероидчувствительныхбольныхИап
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 60%
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •% Отр. 58 Положит. 42 0
- •КоличествоСр(-)больных иаПв%соотношении 80%
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 100%
- •Такимобразом:
- •3.1.3.ХарактеристикастероидрезистентныхбольныхИап
- •%Соотношении
- •В%соотношении
- •Онкология
- •Такимобразом:
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 60%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 100%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 80%
- •Такимобразом:
- •Молекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинарецепторномуровнеубольныхистиннойакантолитическойпузырчаткой
- •ИзучениеуровняэкспрессиимРнКα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Бетарецептор альфарецептор
- •3.2.2АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениинауровнеα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторов
- •3.2.3.Изучениеколичествамембранныхивнутриклеточныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольных
- •10*3/Клетку
- •10*3/Клетку
- •3.2.4АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениимембранныхивнутриклеточныхрецепторов
- •МолекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровнеубольныхИап
- •ИзучениевключениямеченогоуридинавРнКлимфоцитовпериферическойкровиустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Количествовключенногоуридинав
- •Значимыйпоказатель
- •АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениивключения ³н-уридина
- •3.4.РазработкалечениябольныхИаПазатиоприномпристероиднойрезистентности
- •3.4.1Клиническиеданныеприпримененииазатиоприна
- •MaxдозаСгк
- •2 Раза
- •ДинамикакожныхвысыпанийубольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •Осложнения,возникшиеустероидрезистентныхбольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •ИзучениеэкспрессиигенаNf-kBустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИаПиеединамикинафонетерапииазатиоприном
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессииGapdhв% 90
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессии
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNf-kBотносительно экспрессиигеновGapdhв% 90
- •АнализклиническихданныхстероидрезистентныхбольныхИап приизмененииэкспрессиигенаNf-kBнафонетерапииазатиоприном
- •Определениефакторанекрозаопухолиα(tnf-α)убольныхИап
- •Клиническиепримеры больныхИап
- •Патологоанатомический диагноз.Комбинированноеосновноезаболевание.
- •Проведены обследования:
- •60 Преднизолона
- •Преднизолон Метипред
- •Длительностьприемапрепарата
- •Былпроведенонкопоиск:
- •Заключительный клинический диагноз:
- •Глава4.Обсуждение полученных результатов
- •Практическиерекомендации
- •Библиография
1.5.1Общиепредставленияомолекулярной фармакологииСгк
ДействиеСГКнаклетки-мишениреализуетсячерезихсвязываниесвнутриклеточным белком-рецептором. Рецептор СГК является лиганд-
активируемымфакторомтранскрипцииизсуперсемействаядерныхрецепторов.Послесвязываниясгормономипереходаизцитоплазмывядроклеткиглюкокортикоидныйрецептор(ГР)осуществляетпозитивнуюилинегативную регуляцию генов.
ГР-белокчеловека,рецепторглюкокортикоидовифактортранскрипции,относящийсякядернымрецепторам,кодируемыйгеномGCCRна5-йхромосоме.
СтроениеГр:
ГР,находящиесявцитозоле,представляютсобойолигомеры.Каждыйолигомерсостоитизнесколькихдоменов,выполняющихразныефункции(таблица2).
Таблица2.ДоменыГР.
.
N-концевойучастокГР(доменА/В)отличаетсявариабельностью,а
доменыC,DиЕконсервативны.ДоменC,связывающийсясДНК,содержитучасткиС1иС2.С1непосредственносвязываетсясгормончувствительнымиэлементами(ГЧЭ)ДНК,аС2участвуетвобразованиигомодимеровигетеродимеровГР(рисунок2).
Рисунок2.Структурно-функциональнаякартарецептораглюкокортикоидов.
ПрисвязываниисгормономмономерГРотщепляетсяотолигомерногокомплексаистановитсяспособнымкдимеризацииипоследующемувзаимодействиюсГЧЭ,которыеобычнонаходятсяврегуляторныхобластяхгенов.НеобходимоеусловиевзаимодействияCГКсГР-нормальныйтранспортCГКчерезплазматическуюмембрану.Наэтотпроцесс,какинасамовзаимодействиеCГКсцитозольнымивнутриклеточнымирецепторами(ВР),влияютсамиCГКидругиевещества,например,урсодезоксихолеваякислота,карнитин,тиоредоксин.
ПриальтернативномсплайсингеГРвозникаютегоизоформы–α,βиγ[176].
ИзоформыГр:
α-иβ-изоформыГРобразуютсяврезультатеиспользованияальтернативныхакцепторныхсайтовсплайсингавэкзоне9.Этиизоформырецептораидентичнывплотьдоаминокислотногоостатка(а.о.)727,послекоторогоα-изоформаГРсодержит50уникальныха.о.,аβ-изоформаГР–15а.о.α-изоформаГРпредставляетсобойклассическийрецепторСГК,вотсутствиегормонанаходитсявцитоплазмеклеткивкомплексесбелкамитепловогошокаифункционируеткаклиганд-зависимыйтранскрипционныйфактор.Специфичныйдляα-изоформыГРучастоккодируетфрагментлиганд-связывающегодомена,необходимыйдлясвязыванияСГК,длявзаимодействиясбелкамитепловогошока,атакжедлятрансактиваторнойфункциирецептора(районгормончувствительныхэлементов(ГЧЭ).
β-изоформаГРнеспособнасвязыватьсясгормоном,постояннонаходитсявядреклеткииявляетсядоминантнымингибиторомα-изоформыГР.Предложенонесколькомеханизмовантагонистическогодействияβ-изоформыГР,которыевключаютегоконкуренциюсα-изоформойГРзаместапосадкиврегуляторныхрайонахгеновконкуренциюзакоактиваторы,атакжеобразованиенеактивныхгетеродимеровГРα/ГРβ.β-изоформаГРобнаруживаетсяповсеместно,хотявыявляетсянасущественноболеенизкомуровне.Приэтомвнормевбольшинстветканейиклеточныхлиний
содержаниеβизоформыбелкалибовдесяткиразниже,чемсодержаниенормальногорецептора,либоонавообщенедетектируется.Однаковнекоторыхтипахклеток,таких,какнейтрофилыиклеткиэпителияжелчныхпротоковпечениитерминальныхбронхиоллегких,β-изоформаГРэкспрессируетсянавесьмавысокомуровне.Показанотакже,чтоβ-изоформаГРможетстатьдоминирующейприобработкеклетокпровоспалительнымицитокинами:факторомнекрозаопухолиальфа(TNFα)иинтерлейкином1(IL1),иэтоможетбытьмеханизмомразвитиянечувствительностикСГК.Напротив,агенты,увеличивающиеотносительныйуровеньэкспрессииα-изоформы(например,метотрексат),повышаютчувствительностьклетоккСГК[118].Высокийуровеньβ-изоформыГРнаблюдаетсяурядапациентовснечувствительнымикгормональнойтерапииформамиастмы,ревматоидногоартрита,системнойкраснойволчанки,остройлимфобластоиднойлейкемиейидр.[118].
Числогеноввклетке,экспрессиякоторыхнапрямуюрегулируетсяСГКварьируетмежду10и100,нотранскрипциямногихдругихгеновопосредованнорегулируетсяГРпутёмихвзаимодействиясдругимифакторамитранскрипции.ПослеактивациирецепторыСГКобразуютдимер,которыйсвязываетсясоответствующимГЧЭДНК,находящимсяв5'-промоторнойзонестероид-чувствительныхгенов.Этовзаимодействиеизменяетпорядоктранскрипции,вызываяиндукциюилирепрессиюданногогена[69].ГЧЭстимулирующеготипа–этопоследовательностьнуклеотидов,включающая15пароснований-ГГТАЦАnnnТГТТЦТ(гдеn-любойнуклеотид).РепрессиютранскрипцииосуществляютнегативныеГЧЭ(нГЧЭ),которыеимеютболееизменчивуюпоследовательностьрасположениянуклеотидов(АТЦАЦnnТnТГАТЦn).Кгенам,экспрессиякоторыхнегативнорегулируетсяСГКотносятсягеныцитокиновиихрецепторов,геныколлагеназыистромелизина–т.е.биологическиактивныхвеществ(БАВ),принимающихучастиеввоспаленииииммунныхреакциях.
ПомимопростыхГЧЭсуществуюткомбинированныеГЧЭ,которыеимеядругуюпоследовательностьнуклеотидов,являютсяакцепторамидействиядругихядерныхфакторовтранскрипции,вчастностифакторатранскрипции-активаторапротеина(АР-1),состоящегоизпродуктовонкогеновFosиJun[210].АР-1образуетбелок-белковыйкомплекссактивнымГР,предотвращаяеговзаимодействиесДНКисоответственноснижаяответнадействиестероидов.
СпецифичностьузнаваниярецепторамистероидныхгормоновсоответствующихрегуляторныхпоследовательностейвДНКопределяется,главнымобразом,ДНК-связывающимдоменом.Этотдоменможетбытьперенесенввидеотдельногомодуляотодногорецепторакдругому,испособенфункционироватьподконтролемчужеродногостероид-связывающегодомена.
КлючевуюрольвспецифическомузнаванииГЧЭиграютGly-458,Ser-
459иVal-462,расположенныевоснованиипервого"цинковогопальца"вначалеальфа-спирали,укладывающейсявбольшуюбороздкуДНК.Одновременная заменаэтихаминокислотныхостатковнасоответствующиеимостаткиизДНК-связывающегодоменарецептораэстрогеновприводитктому,чтотакоймутантныйГРперестаетузнаватьГЧЭ.Второй"цинковыйпалец"такжеучаствуетвузнаванииГЧЭ.Показано,чторядаминокислотныхостатковэтого"пальца"необходимдлядимеризацииГРиобеспечиваетегоэффективноесвязываниесинвертированнымповтором,образующимGRE[93,94].
ДругиедоменырецепторногобелкатакжевносятвкладвспецифичностьузнаванияГЧЭ.Так,сродствоизолированногоДНК-связывающегодоменаГРктакимэлементамв10-40разниже,чемсродствоинтактногорецептора[95,144].
ВпоследниегодыбылиобнаруженыновыемеханизмывзаимодействияСГКсцитокинами.Известно,чтоцитокиныдействуютнаклеткипутем,изменениятранскрипциигенов.Ихвзаимодействиесрецепторамина
поверхностиклеткиприводиткактивациифакторовтранскрипции,таких,какАP-1иядерныйфакторкаппа-В(NF-kB).Этифакторызатемнаправляютсявядроклетки,гдесвязываютсясДНК(впринципе,такимжепутем,какикомплексглюкокортикоид-рецептор)ивлияют,такимобразом,насинтезм-РНКипродукциюпровоспалительныхпротеинов(цитокинов)вклетке.Оказалось,чтокомплексглюкокортикоид-рецепторможетвзаимодействоватьнепосредственнокаксАP-1,такисNF-kBвядре,предупреждая,такимобразом,ихдействиекакфактортранскрипцииДНКиэффективноблокируявлияниецитокиновнаклетку.Этопротеин-протеиновоевзаимодействие-болеедостоверно,помнениюнекоторыхавторов,объясняеточеньважныймеханизмпротивовоспалительногодействияСГК.ПосколькуNF-kBиАP-1опосредуютхронизациювоспалительныхэффектов,ихинактивацияприводиткугнетению этогопроцесса.
Выделенытристратегии,которыеиспользуютрецепторыстероидныхгормонов длярегуляцииактивностигенов:
Активациятранскрипциигеновпутемсвязываниярецептора,содержащеголиганд,спозитивнорегулируемымГЧЭ.
Репрессиятранскрипциизасчетсвязыванияснегативно-регулируемымГЧЭ.
РегуляциязасчетвзаимодействиярецепторовнесГЧЭ,асучасткамисвязываниядругихтранскрипционныхфакторов.
NF-kB-этоиндуцибельныйрегулятор,которыйпозитивнорегулируетгеныиммуннойсистемыигены,вовлеченныеввоспалительныереакции. СГК,наоборот,являютсямощнымисупрессорамииммунногоивоспалительногооткликовпроцессов.Оказывается,NF-kBиГРфизическивзаимодействуют,иэтоприводиткрепрессиитрансактивирующейактивностифактора.Вгетеродимереp50/p65ингибируетсятрансактиваторныйдоменсубъединицыp65.Ноиактивирующаяроль рецепторагормонавсвою очередь ингибируетсяфактором.Интересно,чтоNF-kBнеблокируетрепрессорнуюфункциюрецептора.ТакиежеантагонистическиевзаимоотношениясNF-kBпоказаны
длядругихрецепторовстероидныхгормонов.Такимобразом,факторNF-kBможетсущественновлиятьнапроцессы,связанныесгормональнойрегуляцией[172].
Ко-активаторстероидныхрецепторов(SRC).Вконце90-хгг.былобнаруженко-активаторстероидныхрецепторов(SRC,steroid-receptorco-activator),которыйнепосредственносвязываетсясAF-2областьюнесколькихядерныхрецепторов,связанныхсосвоимилигандами.Этотко-активаторконститутивноассоциировансCREBсвязывающимбелком,CREB-bindingprotein,CBP.
CBPдалееосуществляетвзаимодействиесосновнымтранскрипционнымаппаратом,вчастностисTFIIB.
СГК подавляют активацию генов воспаления, которые начинают
«запускаться»поддействиемвоспалительногостимула,такихкакIL-1иTNFα.ТакжеактивируетсятранскрипционныйфакторNF-кB,субъединицыфакторар50ир65переносятсявядроисайт,специфическисвязываютсясДНКиско-активаторноймолекулойCBPилирCAF,которыеобладаютгистонацетилтрансферазнойактивностью.Врезультатеацетилирования4гистонакораповышаетсяэкспрессиягенов,кодирующихмножественныепровоспалительныебелки.ГРпослесоединенияслигандом(глюкокортикоидом)переноситсявядро,гдесвязываетсяскоактиваторноймолекулой,ингибируетацетилтрансферазнуюактивностьиактивируетдеацетилазугистонов,котораяпрекращаетацетилированиеиблокируетэкспрессию генов воспаления(рисунок3)[222].
Рисунок3.МеханизмдействиямалыхдозСГК.
Субъединицаядерногофакторар65конкурируетсГРзавзаимодействиесГЧЭ.
СГКблокируютмножественныегенывоспаления,которыеактивируютсяприхроническихвоспалительныхзаболеваниях(геныцитокинов,хемокинов,молекуладгезии,ферментовибелковвоспаления),изменяяацетилированиегистоновпутемсвязыванияскоактиваторноймолекулойCRB(Creb-bindingprotein), обладающейгистонацетилтрансферазнойактивностью(рисунок3).