токсикология
.pdfполигалогенированные бифенилы. С помощью конъюгации с глюкуроновой кислотой метаболизируют и некоторые эндогенные вещества, например стероиды и билирубин.
Фенолы, спирты, карбоновые кислоты, ароматические амины образуют глюкурониды в виде простых эфиров, когда глюкуроновая кислота реагирует с гидроксильной группой, и сложных эфиров в результате реакции с кислотной группой (глюкуроновая кислота реагирует всегда своей альдегидной группой).
В кишечнике под влиянием глюкуронидазы, фермента кишечной мик-
рофлоры, β-глюкурониды могут расщепляться с образованием веществ, способных к реабсорбции и обратному поступлению в кровь (явление кишечнопеченочной циркуляции ксенобиотика).
Сульфатная конъюгация. Сульфатная конъюгация является общей реакцией для большинства млекопитающих. Многие соединения, содержащие фенольные и аминогруппы выделяются из организма в виде конъюгатов с сульфатом. Ксенобиотики, подвергающиеся О-глюкуронидации, подвергаются и сульфатной конъюгации. Сульфатные конъюгаты представляют собой хорошо водорастворимые эфиры серной кислоты.
Реакция катализируется группой ферментов сульфотрансфераз, обнаруженных в печени, почках, кишечнике, легких, мозге. Кофактором реакции служит 3’-фосфоаденозин-5’-фосфосульфат (ФАФС). Сульфатная конъюгация включает перенос SO3– от ФАСФ к ксенобиотикам. Процесс взаимодействия эндогенных сульфатов с ароматическими аминами, алифатическими спиртами и фенолами проходит в несколько этапов. На первом этапе образуется активная форма сульфата - 3-фосфоаденазин-S-фосфосульфат (ФАФС), который в организме синтезируется из АТФ и неорганического сульфата Далее происходит перенос сульфогруппы ФАФС на молекулу-акцептор (фенол, стероиды и др.) с помощью сульфотрансфераз.
151
Сульфатная конъюгация алифатических спиртов и фенолов протекает по следующей схеме:
R-OH + ФАСФ → R-O-SO3Н + ФАФ
Субстраты для реакции не ограничиваются спиртами и фенолами, которые часто являются продуктами реакции 1-й фазы. К ксенобиотикам, не требующим предварительной активации ферментами 1-й фазы относятся первичные и вторичные спирты, желчные кислоты, катехолы, определенные ароматические амины, например, анилин и 2-аминонафтален, конъюгирующие с ФАСФ с образованием соответствующих сульфаматов:
N-гидроксиариламины также являются субстратами для сульфотрансфераз. Во всех случаях реакция включает нуклеофильную атаку атомов кислорода или азота на атом серы в ФАСФ с расщеплением фосфосульфатной связи.
Сульфатные конъюгаты ксенобиотиков экскретируются в основном с мочой. Метаболиты, экскретируемые с желчью могут быть гидролизованы арилсульфатазами, присутствующими в микрофлоре кишечника, что способствует энтеропеченочной циркуляции ксенобиотика.
Сульфатазы присутствуют и в эндоплазматическом ретикулуме и в лизосомах, где преимущественно гидролизуют сульфаты эндогенных соединений. Некоторые сульфатные конъюгаты подвергаются дальнейшей биотрансформации. Сульфатирование благоприятствует дейодированию тироксина и трийодтирозина и может определять скорость элиминирования тиреоидных гормонов.
Относительно низкая концентрация ФАСФ в клетке (около 75мкм, для сравнения – концентрация УДФ-глюкуроновой кислоты составляет около 350мкм) ограничивает возможности сульфатной конъюгации ксенобиотиков. Поэтому при высоких токсических нагрузках это приводит к переключению метаболизма на другие пути, в частности в сторону образования β-глюкуро-
152
нидов. В целом этот путь биотрансформации представляется высокоспецифичным, но низкоемким. Ряд соединений одновременно являются субстратами и для сульфотрансфераз и для УДФ-глюкуронозилтрансфераз, при этом выбор пути метаболизма может зависеть от концентрации субстрата, доступности кофакторов и т.д. Например, относительное содержание продуктов метаболизма ацетаминофена зависит от дозы препарата: при низких дозах преобладают сульфатные конъюгаты, а с увеличением дозы происходит насыщение метаболического пути и, возможно, за счет ингибирования активности сульфотрансфераз, снижение относительного количества сульфатных конъюгатов по сравнению с глюкуроновыми.
Обнаружены множественные формы сульфотрансфераз, которые являются членами одного семейства, которое подразделяется на ряд подсемейств: 1А, 1В, 1С, 1Е, 2А, 2В и 3А исходя из гомологии аминокислотной последовательности. Так как номенклатура индивидуальных форм ферментов не разработана окончательно, поэтому иногда сульфотрансферазы подразделяют на 5 классов исходя из субстратной специфичности: арилсульфотрансферазы - сульфатируют большое количество фенольных ксенобиотиков; алкогольсульфотрансферазы - метаболизируют первичные и вторичные спирты, включая неароматические гидроксистероиды; эстрогенсульфотрансфераза – ароматические гидрооксистероиды; тирозинсульфотрансфераза – тирозин метиловые эфиры, желчные кислоты.
В целом, сульфатирование эффективно снижает фармакологическую и токсикологическую активность ксенобиотиков. Однако в некоторых случаях сульфатирование увеличивает токсичность чужеродных соединений, поскольку отдельные сульфатные конъюгаты химически нестабильны и деградируют, формируя сильные электрофильные соединения. Сульфатная конъюгация является необходимым этапом активации многих проканцерогенов, таких как ацетиламинофлуорен, ариламины, эстрадиол и
153
др. Многие N-гидрок-сиариламины и гидроксамовые кислоты обладают мутагенным эффектом в присутствии сульфотрансферазной активности. Для детектирования мутагенного эффекта важно, что сульфатирование имеет место внутри клеток-мишеней, поскольку сульфатные конъюгаты из-за своего заряда не могут проникнуть сквозь клеточные мембраны.
Таким образом, сульфатная конъюгация, является системой с «высоким сродством, но малой мощностью», глюкуроновая конъюгация, напротив - с «малым сродством, но высокой мощностью».
Конъюгация с глутатионом и цистеином. Органические вещества, со-
держащие в молекуле лабильные атомы водорода, галогенов и др., в организме могут взаимодействовать с SH-содержащими эндогенными соединенииями: глутатионом, цистеином, ацетилцистеином, и т.д.
Реакции конъюгации восстановленного глутатиона (трипептид, состоящего из глицина, цистеина и глутаминовой кислоты) с электрофильными субстратами катализируют ферменты глутатион-S-трансферазы (GST). Механизм, с помощью которого глутатион-S-трансфераза усиливает скорость конъюгации, состоит в депротонировании восстановленного глутатиона. В этой реакции принимает участие тирозинат Tyr-O- , расположенный в активном центре фермента. На рисунке представлена типичная реакция, катализируемая глу- татион-S-трансферазой:
Эти ферменты обнаружены в большинстве тканей, а именно в печени, почках, тонком кишечнике, легких и т.д. 95% от общего содержания фермента локализовано в цитоплазме и около 5% - в эндоплазматическом ретикулуме. Хотя GST обнаружены практически во всех тканях организма млекопитающих, максимальная их активность обнаружена в печени. В этом органе GST
154
составляет до 10% общего количества цитозольных белков. глутатион-S- трансферазы представлены семейством мультифункциональных изоферментов, которые способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая 1) каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с восстановленным глутатионом; 2) некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-гидропероксидов через экспрессию активности глутатионпероксидазы 2 (селеннезависимой).
Субстраты для глутатионовой конъюгации можно разделить на две группы: 1) достаточно электрофильные для осуществления прямой конъюгации, 2) требующие активации до реакции конъюгации.
Глутатион-S-трансфераза играют важную роль в детоксикации широкого спектра ксенобиотиков: фосфорорганических инсектицидов, гербицидов, пестицидов, афлатоксина В, бенз[а]пирена, многих химиотерапевтических препаратов. Кроме этого фермент участвует в биосинтезе биологически активных молекул, включая лейкотриены и простагландины.
Активность глутатион-S-трансфераз индуцируется при поступлении в организм различных ксенобиотиков. В подавляющем большинстве случаев взаимодействие ксенобиотиков с глутатионом приводит к их детоксикации.
В результате в реакции конъюгации с глутатионом из организма выделяется метаболит в связанной с N-ацетилцистеином форме (меркаптуровые кислоты). Аналогичным образом происходит взаимодействие ксенобиотиков с цистеином и ацетилцистеином:
Меркаптуровые кислоты образуются в организме при введении животным некоторых ароматических углеводородов и галогенили нитропроизводных алифатических и ароматических углеводородов.Меркаптуровые кислоты являются S-арил- или S-алкил- N-ацетилцистеинами.
155
Образование их многоступенчато. В результате цепи ферментативных реакций образуются премеркаптуровые кислоты, выделяющиеся с мочой. При обработке мочи минеральной кислотой (in vitro) получается меркаптуровая кислота.
Непосредственное образование в организме самой меркаптуровой кислоты имеет место при замещении лабильного атома галоида или нитрогруппы углеводорода. Возможно образование и других типов меркаптуровых кислот при биотрансформации некоторых серосодержащих ароматических соединений, а также бромалканов.
Ацетилирование. Это основной путь биотрансформации для ароматических аминов или ксенобиотиков, содержащих гидразогруппу (R-NH-NH2), которые превращаются в ароматические амиды (R-NH-COCH3) или гидразиды (R-NH-NH-COCH3), соответственно. Первичные алифатические амины редко подвергаются N-ацетилированию за исключением цистеиновых конъюгатов, образующихся из глутатионовых, которые, в свою очередь, путем N- ацетилиро-вания в почках превращаются в меркаптуровую кислоту. Многие N-ацетилиро-ванные метаболиты менее, чем исходные соединения, растворимы в воде. Однако в отдельных случаях, например, для изониазида, N- ацетилирование облегчает экскрецию метаболитов с мочой.
Реакция N-ацетилирования катализируется ферментами, называемыми N-ацетилтрансферазы и требует присутствия ацетил-кофермента А (ацетилКоА) в качестве кофактора. Реакция протекает в два последовательных шага. Первым этапом ацетильная группа КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с высвобождением кофермента А:
E-SH + КоА-S-СОСН3 → E-S-COCH3 + КoA-SH
Вторым шагом ацетильная группа переносится с ацетилированного фермента на аминогруппу субстрата:
R–NH 2 + E-S-COCH3 → R–NH–COCH 3 + Е-SH
156
Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования определяется первым шагом, тогда как для слабоосновных – вторым. В определенных случаях N-ацетилтрансферазы могут катализировать реакцию О-ацетилирова- ния. N-ацетилтрансферазы это цитозольные ферменты, которые были обнаружены в печени и многих других тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, неспособных к N-ацетилированию ксенобиотиков.
У кроликов, мышей экспрессируется две формы N-ацетилтрансферазы, обозначаемых NAT1 и NAT2. Они являются близкими по первичной структуре (79-95% гомологии аминокислотной последовательности, в зависимости от вида). У всех белков в активном центре присутствует цистеин (Cys68). Оба белка кодируются генами, не содержащими интронов. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, тогда как NAT2, по-видимому, только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности, хотя и имеется перекрывание. Субстратами NAT1, являются парааминосалициловая кислота, парааминобензойная кислота, сульфаметоксазол. Субстраты NAT2 включают изониазид, гидралазин, сульфаметазин, дапсон. Некоторые ксенобиотики, например, 2-аминофлуо- рен одинаково хорошо метаболизируются обоими ферментами.
Серия клинических наблюдений, проведенных в 50-х годах XX века, установила существование у человека т.н. «медленных»» ацетиляторов антитуберкулезного препарата изониазида. Встречаемость этого фенотипа довольно высокая на Среднем Востоке (около 70% в Египте и Саудовской Аравии), средняя в Европе, на Кавказе, в Америке и Австралии (около 50%), низкая в азиатской популяции (менее 25% в Китае, Японии, Корее). В настоящее время варианты по статусу ацетилирования описаны и у человека и у животных. «Медленные» ацетиляторы, которые к тому же дефицитны по
157
глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназе, особенно склонны к гемолизу под действием определенных сульфаниламидов.
Не только уксусная кислота, но и другие органические кислоты способны превращаться в организме в активную форму, вступая во взаимодействие с КоА (жирные кислоты, карболовая кислота, бензойная кислота, фенилуксусная кислота и др.). В этой форме вещества вступают в реакцию взаимодействия с соединениями, содержащими аминогруппу (глицином, глутаматом), с образованием конъюгатов. Так, известно, что при поступлении в организм бензойной кислоты с мочой выделяется гиппуровая кислота. Гиппуровая кислота представляет собой конъюгат бензойной кислоты с глицином. В данном случае эндогенная молекула глицина выступает в качестве акцептора, с которым связывается бензойная кислота, активированная КоА.
Метилирование. Для многих веществ процесс биотрансформации завершается этапом метилирования молекулы. Метилированию могут подвергаться молекулы, содержащие гидроксильные, сульфгидрильные и аминогруппы в структуре. Основным источником метильных групп служит метионин, превращающийся при участии АТФ в кофермент S-аденозилметионин (SАМ). Последний под влиянием соответствующих O-, S-, N-метилтрансфераз отдает метильные группы соответствующему чужеродному соединению.
ROH + S-аденозилметионин → ROCH3
Среди эндогенных веществ, таким образом, при участии фермента ка- техол-О-метилтрансферазы метаболизируют адреналин, норадреналин, дофамин. При этом образуются малоактивные 3-метоксипроизводные катехоламинов.
Метаболизм химических соединений также возможен при участии кишечной флоры. Действие бактериальных ферментов сопровождается расщеплением продуктов 2-ой фазы метаболизма, поступающих в кишечник с желчью, и образованием исходных метаболитов. Этот процесс проходит
158
при участии гидролаз, разрушающих глюкурониды и сульфаты. Реабсорбция образовавшихся веществ замыкает цикл внутрипеченочной рециркуляции токсикантов. Кроме того, анаэробная среда кишечника обеспечивает возможность восстановления некоторых химических веществ бактериями. Например, восстановление нитроароматических соединений сопровождается образованием аминов, которые, поступая в печень, вновь подвергается метаболизму.
Биотрансформация металлов. В отличие от многих органических веществ металлы и их соединений, попадая в организм, многократно могут менять свою форму. Любые металлы большую часть пребывания в организме существуют в виде комплексов с белками. Исключение составляют щелочные и, частично, щелочноземельные металлы, первые содержатся в жидкой фазе в ионной форме, вторые частично образуют непрочные, легко гидролизуемые комплексы. Для металлов характерно также комплексирование с нуклеиновыми кислотами. Помимо перечисленных комплексов металлы соединяются с активными группами биокомплексонов: ОН, СООН, РО3Н и лимонной кислотой. Существует сродство отдельных металлов к белкам и аминокислотам. Известно, что с аминокислотами соединяются: Нg, Сu, Ni, Рb, Zn, Со, Сd, Мn, Мg, Са, Ва; при этом преимущественно через SН-группы: Нg, Аg, Рb, Сu, Zn, Со; через СООН-группы: Сu, Ni, Zn, Мg, Са.
Депонирование металлов происходит в виде комплексов, в некоторых случаях специфических: так, уран образует прочные комплексы и откладывается в тканях, содержащих карбонильные и фосфорильные группы.
Металлопротеидный комплекс свинца в клетках печени содержит аспарагиновую и глутаминовую кислоты. В клетках эпителия почек обнаружен относительно устойчивый свинцово-белковый комплекс, включающий ряд аминокислот (глицин, треонин, аланин, цистеин, глутамин, аспарагин).
159
Металлы преимущественно с переменной валентностью подвергаются в организме восстановлению и окислению. Так, пятивалентный мышьяк восстанавливается в организме до более токсичного трехвалентного. Имеются сведения, что восстановление до трехвалентной формы имеет место для селена и теллура, возможно даже и до элементарного состояния. Шестивалентный хром восстанавливается до трехвалентного, легко комплексирующегося с белками. Ванадий восстанавливается из пятивалентного в трехвалентный; предполагается также восстановление в организме марганца и свинца.
Уран и плутоний могут служить примером биологического окисления: четырехвалентный плутоний переходит в шестивалентный. Реакции метилирования известны для селена, теллура и серы с образованием летучих диметиловых производных.
Факторы, влияющие на метаболизм ксенобиотиков. Способность органов и тканей метаболизировать ксенобиотики зависит от набора и активности ферментов, участвующих в процессе биотрансформации. В значительной степени активность ферментов является внутренней характеристикой конкретной ткани, определяется генетическими особенностями организма и зависит от пола и возраста. Дополнительными факторами, порой существенным образом влияющими на содержание и активность ферментов, являются условия окружающей среды. Это, прежде всего, химические вещества, выступающие в качестве индукторов или ингибиторов ферментов, питание и действие патогенных факторов.
Факторы, влияющие на метаболизм ксенобиотиков можно подразделить на генетические (вид, пол), физиологические (возраст, характер питания и др.); нефизиологические, повреждающие структуру органа (хлорированные углеводороды, тироксин, аллоксан, морфин, гепатоэктомия, адреналэктомия, кастрация самцов, голодание и др.); химические факторы, являющиеся индукторами (барбитураты, полициклические углеводороды, андрогенные стероиды, анаболические стероиды, глюкокортикоиды и др.) и ингибиторами
160