токсикология

Многие ксенобиотики образуют нековалентные связи с ДНК. При этом меняется конформация макромолекул. Так, известно высокое сродство к нуклеиновым кислотам производных акридина, которые, встраиваясь в молекулу ДНК между соседними парами оснований (интеркалация), изменяют её структуру. Таков же, вероятно, механизм действия этидиумбромида, профлавина и др.

Антрациклин, хлорахин, актиномицин и некоторые другие антибиотики также изменяют конформацию нуклеиновых кислот, не образуя с ними ковалентных связей.

Взаимодействие токсикантов с липидами. Важнейшая функция липи-

дов - формирование биологических мембран. Вещества, которые разрушают или изменяют структуру липидов, нарушая взаимодействие между молекулами липидов (гидрофобные связи) повреждают биологические мембраны. Такие вещества поэтому называются мембранотропными. К числу таких относятся многие спирты, предельные и галогенированные углеводороды («неэлектролиты» по Н.В. Лазареву), детергенты (поверхностно-активные вещества), а также токсические вещества, обладающие фосфолипазной активностью (яды змей и т.д). Ряд токсикантов оказывает опосредованное мембранотоксическое действие, повышая уровень внутриклеточного Са2+, активируя эндогенные фосфолипазы, свободнорадикальные процессы в клетках и т.д.

Современные методы изучение локализации рецепторов и их взаимодействия с токсикантами. Выяснение характера распределения рецепторов различных токсикантов в тканях, клетках, субклеточных структурах возможно с помощью различных методических приемов. Непрямым методом является обнаружение в исследуемом материале эндогенных биорегуляторных веществ, аналогами которых является токсикант, или ферментов их обмена. Как правило, для этой цели используют гистологические методы (гистохимия, иммуногистохимия). Такими способами, например, выявляют области синтеза, депонирования или

81

разрушения нейромедиаторов (ГАМК, серотонина, дофамина, норадреналина, гистамина и т.д.).

Часто для выявления рецепторов в органах и тканях используют метод авторадиографии. При этом о характере их распределения часто судят по особенностям связывания токсикантов, меченых радиоактивными изотопами (радиолигандов). С помощью этого метода возможно изучение и внутриклеточной локализации рецепторов.

Метод компьютерной томографии, в частности позитронно-эмис- сионная компьютерная томография, позволяет прижизненно изучать локализацию рецепторов токсикантов в тканях. Для этого в организм обследуемого вводят рецепторспецифичные радиолиганды (сам токсикант или его аналоги), меченные радионуклидами, испускающими позитроны, локализацию которых в различных органах, по прошествии некоторого инкубационного периода, и выявляют с помощью соответствующей аппаратуры. С помощью такого подхода можно изучить распределение рецепторов в любом интересующем органе.

Селективное связывание токсиканта с рецепторами одного типа характерно для очень небольшого числа высокотоксичных соединений (например, некоторые ФОС, ботулотоксин, сакситоксин, тетродотоксин, аманитин). Часто вещество имеет примерно одинаковое сродство к нескольким рецепторам, взаимодействие с которыми и приводит к формированию вполне определенного биологического эффекта (профиля токсических реакций). В этой связи, особенности проявлений интоксикации одним и тем же веществом, но различных степеней тяжести, обусловлено не только увеличением количества рецепторов одного типа, связавшихся с токсикантом, но и расширением спектра вступивших во взаимодействие рецепторов.

В ряде случаев токсический эффект в большей степени связан с взаимодействием ксенобиотика с менее чувствительными, но более значимыми для поддержания гомеостаза рецепторами. Так, интоксикация

82

нейролептиками в основном проявляется эффектами, обусловленными блокадой холинэргических структур (эти нарушения, устраняются в значительной степени ингибиторами холинэстеразы).

При изучении механизмов токсического действия веществ, важным является определение рецепторного профиля их действия в широком диапазоне доз. В ходе этих исследований изучают виды рецепторов, с которыми может вступить во взаимодействие токсикант и количественные характеристики этого взаимодействия. Сравнение биологических эффектов, вызываемых действием на организм близких по строению, но различающихся по рецепторному профилю токсикантов, позволяет оценить значение каждого из механизмов формирования токсического процесса.

Поскольку токсичность веществ во многом определяется их способностью взаимодействовать с рецепторами определенных типов, количественная оценка сродства конкретного вещества к конкретному рецептору порой имеет решающее значение для выявления механизма его токсического действия.

Количественно оценить сродство токсиканта к рецептору можно с помощью радиолигандного метода исследования. И хотя эффекты, развивающиеся вследствие взаимодействия, остаются вне поля зрения исследователя и в ходе работы не представляется возможным решить вопрос, является ли исследуемое вещество агонистом или антагонистом (активатором или ингибитором) данного рецептора, тем не менее, сочетание данного метода с биохимическими и физиологическими методиками позволяет получить развернутую картину механизма действия токсиканта и формирования ответной реакции биосистемы.

Принцип метода радиолигандного метода состоит в добавлении в инкубационную среду, содержащую рецептор, меченного изотопом токсиканта (радиолиганда) в возрастающей концентрации. Метод пригоден для исследования свойств веществ, прочно фиксирующихся на рецепторе (например, холинолитиков: скополамин, атропина, дитрана и т.д.). В ходе

83

экспериментов изучают зависимость количества образовавшегося радиоли- ганд-рецептор-ного комплекса от концентрации радиолиганда при постоянном содержании в среде соответствующих рецепторов. После получения необходимых данных (как правило, представляемых в графической форме), можно рассчитать количественные характеристики процесса (константу диссоциации комплекса токсикант-рецептор), используя общие положения закона действующих масс. Сравнивая величины констант диссоциации веществ, оценивают их сродство к изучаемому рецептору.

3.6 Общие закономерности резорбции, распределения, биотрансформации и выделения токсикантов

Поведение в организме чужеродных соединений, может быть представлено в общем виде следующим образом (рис. 6).

Рис.6. Общая схема прохождения токсикантов через организм Однако многие токсиканты проходят через организм более укорочен-

ный путь, определяемый обычно их физико-химическими свойствами. Поступление (резорбция) чужеродных веществ в организм, распреде-

ление между органами и тканями, метаболизм (биотрансформация) и выделение требует их проникновения через ряд биологических мембран. В связи с этим необходимо рассмотреть основные механизмы посредством которых осуществляется этот процесс.

84

3.6.1. Основные механизмы резорбции веществ

Биологические мембраны, наряду с цитоскелетом, формируют структуру живой клетки. Клеточная или цитоплазматическая мембрана окружает каждую клетку. Ядро окружено двумя ядерными мембранами: наружной и внутренней. Все внутриклеточные структуры: митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы, фагосомы, синаптосомы и т.д. представляют собой замкнутые мембранные везикулы (пузырьки). Каждый тип мембран содержит специфический набор белков – рецепторов и ферментов; но основа любой мембраны – бимолекулярный слой липидов (липидный бислой), который во всякой мембране выполняет две главные функции: барьера для ионов и молекул и структурной основы (матрицы) для функционирования рецепторов и ферментов

Все мембранные системы организма имеют в основном общее строение и аналогичные функциональные свойства. Мембраны представляют собой структуры, образованные белково-фосфолипидными комплексами, обладающие ограниченной проницаемостью для тех или иных соединений.

Согласно современным представлениям, все клеточные и внутриклеточные мембраны устроены сходным образом: основу мембраны составляет двойной молекулярный слой липидов (липидный бислой) на котором и в толще которого находятся белки (рис. 7).

Рис. 7. Общая схема строения биологических мембран.

По весу мембраны состоят наполовину из белков, наполовину – из липидов, но во внутриклеточных мембранах, содержащих переносчики

85

электронов (внутренние мембраны митохондрий, мембраны микросом). относительное количество липидных и белковых молекул в мембранах варьирует от 20% - белок + 80% - липиды до 75% - белок + 25% – липиды. Углеводы содержатся в форме гликопротеинов, гликолипидов и составляют 0,5-10% вещества мембраны. В состав липидов мембран входят в основном фосфолипиды, сфингомиелины и холестерин. Например, в мембранах эритроцитов свиньи их содержание, составляет, соответственно 36, 30 и 22 % по весу; еще 12% приходится на гликолипиды основные фосфолипиды мембран - это фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и кардиолипин.

Липидные бислои образуются амфифильными молекулами фосфолипидов и сфингомиелина в водной фазе. Амфифильными эти молекулы называют потому, что они состоят из двух частей, различных по своей растворимости в воде: полярной “ головки”, обладающей высоким сродством к воде, т. е. гидрофильной, и “ хвоста” образуемого неполярными углеводородными цепями жирных кислот; эта часть молекулы обладает низким сродством к воде,

т. е. гидрофобна.

Молекулы фосфолипидов имеют форму сплюснутого с боков цилиндра, а по длине как бы делятся на две неравные части: небольшую "голову", состоящую из полярных групп, и длинный "хвост", образованный углеводородными цепями жирных кислот, входящих в состав фосфолипида.

В мембране "жирные хвосты" упрятаны внутрь, а снаружи в контакте с водным окружением оказываются полярные "головы" этих молекул.

Белки мембран принято делить на интегральные и периферические.

Интегральные белки имеют обширные гидрофобные участки на поверхности и нераствориммы в воде. С липидами мембран они связаны гидрофобными взаимодействиями и частично погружены в толщу липидного бислоя, а зачастую и пронизывают бислой, оставляя на поверхности сравнительно небольшие гидрофильные участки. Периферические белки связаны с поверхностью липидного бислоя электростатическими силами.

86

Вклеточных мембранах существуют ультрамикроскопические поры, образованные гидрофильным веществом в преимущественно липидных частях мембран. Мембраны и поры имеют определенные заряды.

Поступление в организм, распределение вредных веществ в органах и тканях, метаболизм и выделение из организма в значительной степени определяются их способностью проходить через биологические мембраны и характером взаимодействия с ними.

Внастоящее время известны четыре основных механизма транспорта химических веществ через биологические мембраны: диффузия, фильтрация, цитоз и активный транспорт.

Диффузия. Процесс проникновения жирорастворимых веществ через липидные мембраны можно рассматривать с позиций простой диффузии, выделив при этом три этапа:

1. Переход молекулы из водной фазы в гидрофобную фазу биологической мембраны;

2. Диффузия молекул в мембране;

3. Переход из липидной в водную фазу.

Этот процесс осуществляется через клеточные мембраны в направлении градиента концентрации. Скорость простой диффузии вещества, согласно закону Фика, описывается уравнением:

V = k × A(C1 − C2 ) , d

где V - скорость диффузии;

k - коэффициент диффузии данного вещества; A - площадь мембраны;

(С1 - С2) - градиент концентрации по обе стороны мембраны; d - толщина мембраны.

Коэффициент диффузии вещества зависит от молекулярной массы, степени растворимости в липидах, а также от пространственной конфигурации (для различных веществ можно найти в справочниках). С

87

увеличением молекулярной массы вещества величина коэффициента диффузии, как правило, уменьшается.

Липидорастворимые неэлектролиты (спирты, хлорированные углеводороды, эфиры) легко проникают через клеточные мембраны и накапливаются в средах организма в неионизированном состоянии. Электролиты (соли тяжелых металлов) находятся в ионизированном состоянии при биологических значениях рН и поэтому плохо проникают через мембраны пищеварительного тракта, плаценту. Слабые кислоты (барбитураты, сульфаниламиды

идр.), наоборот, в желудке переходят в неионизированную форму и, хорошо растворяясь в липидах, поступают в кровь. Их всасывание происходит в кишечнике. Слабые основания (алкалоиды) полностью переходят в желудке в ионное состояние, и поэтому всасывания не происходит. В кишечнике, в нейтральной или близкой к нейтральной среде, алкалоиды переходят в неионизированное состояние, и начинают интенсивно всасываться. Из крови они могут переходить через эпителиальную мембрану желудка.

Простая диффузия характерна для прохождения веществ через многие биологические барьеры и учитывается при оценке распределения токсикантов в организме.

Фильтрация осуществляется через липопротеиновые структуры мембран, которые имеют поры диаметром 3-4 нм. Под фильтрацией понимают процесс просачивания жидкости с растворенными в ней молекулами веществ под действием механической силы (гидростатическое, осмотическое давление) через пористые мембраны, задерживающие крупнодисперсные частицы. Размер фильтруемых частиц определяется размерами пор мембраны. Поскольку диаметр пор биологических мембран мал, в организме путем фильтрации разделяются не только грубодисперсные "частицы" (клетки крови), но

ирастворенные в биологических жидкостях молекулы (ультрафильтрация).

88

Скорость фильтрации или объем жидкости, проходящий через пористую мембрану за единицу времени зависит от: различия гидростатического давления по обе стороны мембраны, т.е. градиента давления; вязкости жидкости, которая в свою очередь, зависит от температуры, проницаемости мембраны, которая определяется размерами пор, их числом, структурой, особенностями взаимодействия стенки мембраны с жидкостью, а также площади фильтрующей поверхности. На скорость фильтрации ксенобиотиков в органах, кроме того, влияют такие факторы как: давление крови, количество функционирующих фильтрующих образований, размеры и форма молекул, особенности взаимодействия с порами.

Фильтрация осуществляется главным образом в капиллярном отделе кровеносного русла: капилляры проницаемы для низкомолекулярных веществ. На принципе фильтрации основана работа гломерулярного аппарата почек, в котором происходит образование первичной мочи. Путем фильтрации из организма выделяется подавляющее большинство ксенобиотиков.

Проникновение через водные каналы (поры) определяется размерами молекулы и практически не зависит от коэффициента распределения в системе масло/вода. Молекулы малого размера свободно проходят через поры. Если диаметр молекулы больше диаметра пор, она не проникает через мембрану. Для ионов и крупных молекул поры недоступны вследствие наличия заряда у входа в поры и малого диаметра самих пор. Мембраны такого типа преодолевают крупные молекулы, способные растворяться в липидах. с увеличением размеров молекул их взаимодействие со стенками белковых каналов все в большей степени препятствует свободной диффузии. Так, радиус пор мембран эпителия желудочно-кишечного тракта составляет 0,3 - 0,8 нм. Химические вещества, поступающие в организм per os, и имеющие молекулярную массу менее 400 дальтон, могут проходить через эпителий кишечника, но лишь при условии, что молекулы имеют

89

цилиндрическую форму. Для молекул шарообразной формы, граница проницаемости через эпителий желудочно-кишечного тракта - 150-200 дальтон. В целом диффузия водорастворимых веществ через барьеры также описывается уравнением Фика, однако, в качестве диффузионной поверхности следует учитывать только эффективную интегральную площадь пор.

Цитоз. Процесс транспорта веществ через мембраны путем образования везикул, содержащих эти вещества, называется цитозом. На основе данных гистологических исследований выделяют несколько видов цитоза: эндоцитоз, экзоцитоз, трансцитоз, синцитоз, интрацитоз.

Эндоцитоз – это захват вещества клеткой. Различают следующие формы эндоцитоза: фагоцитоз – захват корпускулярных частиц; пиноцитоз

– захват капель жидкости и растворенных в ней молекул и рецепторобусловленный эндоцитоз – связывание макромолекул на специфических рецепторах клеточной мембраны с последующим образованием шероховатых везикул.

Путем фагоцитоза клетка захватывает большие частицы или макромолекулярные комплексы. При контакте с клеточной мембраной объект начинает погружаться в клетку, пока полностью не захватывается ею. Отшнуровавшаяся от клеточной мембраны везикула, содержащая частицы, перемещается в цитоплазму. Размеры везикулы и содержащейся в ней частицы могут составлять несколько микрон. Таким способом, например, легочные макрофаги захватывают частицы водонерастворимых чужеродных веществ (металлическая, угольная пыль и т.д.) попавшие в дыхательные пути.

Пиноцитоз - процесс активного поглощения клеткой жидкостей или коллоидных растворов различных веществ. С его помощью в клетку проникают вещества с высокой молекулярной массой. Капли жидкости, с растворенными в ней веществами, окружаются клеточной мембраной; в результате образуются везикулы с диаметром около 0,1 мкм.

90