токсикология

3.9. Токсикологические термины и их характеристика

Перед рассмотрением вопросов по частной токсикологии необходимо дать пояснения некоторым наиболее часто используемым терминам.

Аллергены – химические, физические или биологические агенты, повышающие ответную реакцию организма.

Аллергическое действие – искаженная, повышенная ответная реакция организма.

Эмбриотоксичность – любой токсический эффект у эмбриона и плода, включая структурные и функциональные нарушения или постнатальные проявления таких эффектов. Эмбриотоксические эффекты могут включать врожденные аномалии, внутриматочную гибель и повреждение постнатальных функций.

Тератогенность – способность вещества вызывать структурные и функциональные дефекты в период развития организма (у зародыша или плода).

Гонадотоксическое действие – свойства вещества, которые отрицательно влияют на половые железы и систему регуляции.

Репродуктивная токсичность – вредное влияние на плодовитость, беременность или потомство, вызванное воздействие веществ на любого из родителей.

Мутагенное действие – вещества, вызывающие мутацию, т. е. нарушение передачи генетической информации и свойственных признаков данного вида и особей.

3.10. Токсикологическая оценка лекарственных средств, кормодобавок, пестицидов и др., применяемых в ветеринарии

Токсичность вещества определяется как его способность причинять вред живому организму. Задачей токсикологических исследований является определение степени опасности при однократном и многократном применении. При необходимости более глубокие исследования проводят токсикологи специализированных лабораторий.

191

Определение острой токсичности предусматривает проведение токсикометрической оценки и изучение симптомокомплекса интоксикации при однократном поступлении препарата в организм. Введение препарата животным производится тем способом, который предусмотрен для применения его в ветеринарии и животноводстве. Рекомендуется также определить токсичность и при других способах введения.

При исследовании нового препарата известной фармакологической группы токсичность его определяют в сравнении с токсичностью известного химического соединения (базовый вариант) не менее, чем на 2-х видах лабораторных животных. Токсичность препарата новой группы дополнительно устанавливают на том виде животных, для которых он предназначен.

В опытах используют клинически здоровых животных, ранее не подвергавшихся токсическому воздействию: белых мышей массой 18-20 г, белых крыс 180-200 г. и кроликов 2000-2200 г.

Исследуемое вещество вводят натощак, после 12-часовой голодной выдержки животных. Существует определенный набор методов и способов введения препаратов, причем для каждого из них устанавливается максимально допустимый объем вводимого раствора, эмульсии или водной взвеси

(табл.15).

Таблица 15 Максимально допустимые объемы растворов при различных способах введе-

ния препаратов лабораторным животным.

	Вид животных	Способ введения	Наибольший объем
			вводимого раствора
		внутрь	0,6
	Белые мыши	подкожно	1,0
		внутримышечно	0,5
		внутрибрюшинно	2,0
	Белые крысы	внутрь	8,0
		подкожно	10,0
		внутримышечно	5,0
		внутривенно	6,0

192

	внутрибрюшинно	5,0
	внутрь	50,0
	подкожно	30,0
Кролики	внутримышечно	30,0
	внутривенно	20,0
	внутрибрюшинно	20,0

В зависимости от физико-химических свойств нового препарата, его назначения и показаний к применению, токсикологические исследования могут быть выполнены на морских свинках, кошках и собаках. Подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное введение производится с соблюдением правил асептики и антисептики, внутривенное введение у кроликов осуществляется в ушную вену, у белых крыс и мышей - в хвостовую.

Основным способом при изучении острой токсичности препаратов является введение испытуемого вещества непосредственно в желудок. Для этого используют обычный медицинский шприц типа "Рекорд" объемом 1,0-20,0 мл или шприц "Жанэ" на 100 мл в зависимости от количества вводимого раствора. При введении кроликам удобнее использовать зевник с отверстием, через которое пропускают резиновый катетер длиной около 40 см и диаметром 4-6 мм. Мелким грызунам препарат вводят непосредственно через металлический зонд, в качестве которого используют обычный молочный катетер (белым крысам) или обрезанную и отшлифованную с напоем олова инъекционную иглу (белые мыши). При введении препарата животных фиксируют в вертикальном положении с незначительно запрокинутой головой и осторожно легкими вращениями вводят зонд в желудок. Раствор вводят медленно. Корм животным дают через 2-3 часа с момента введения.

Для растворения препарата чаще всего используют прокипяченную и отстоявшуюся воду комнатной температуры, при плохой растворимости - подсолнечное или другое растительное масло, реже другие растворители с учетом их физиологической совместимости. Выбор растворителя производят

впоисковых опытах, где изучают степень растворимости данного препарата

вводных, масляных и спиртовых растворах (вес. %). Нерастворимые вещест-

193

ва вводят в желудок в виде эмульсии или суспензии. В качестве эмульгатора используют яичный желток, которым эмульгируют растительное масло с последующим разбавлением смеси водой до нужной концентрации. Количество введенного раствора или эмульсии должно быть адекватным дозе и объёму.

Приготовление эмульсии. Берут 5 г растительного масла и прибавляют 7,5 г яичного желтка, освобожденного от белка. Предварительно желток тщательно растирают в ступке с навеской исследуемого вещества и затем по каплям при постоянном помешивании добавляют растительное масло и далее воду до заданного объема. Следует учитывать, что эмульгатор может замедлить или ускорить всасывание данного вещества, ослабить или усилить его токсичность. Чтобы избежать ошибок при оценке токсических свойств препарата, животным контрольной группы в том же объеме вводят эмульгатор (растворитель). В том случае, когда расчетный объем раствора или эмульсии превышает предельно допустимый, его вводят в 2 приема с интервалом в 1 час.

Определение острой токсичности, помимо принудительного введения препарата в желудок, можно также проводить методом свободного скармливания в смеси с излюбленным кормом. Данный метод приемлем том случае, если вещество не ухудшает вкусовых качеств корма и охотно поедается лабораторными животными. Необходимым условием для правильной оценки результатов острого опыта данным способом является полнота поедания всей порции приготовленного корма и индивидуальное скармливание расчетных доз животных. В качестве основы для смешивания можно рекомендовать комбикорма в количестве суточной нормы для каждого вида животного. Для улучшения вкусовых качеств в него можно добавлять в небольших количествах (5-7%) подсолнечный жмых или поджаренные и измельченные семена подсолнуха.

В токсикологическом эксперименте для испытания каждой дозы используют группу лабораторных животных, состоящую из 8-10 особей обоего пола (по 4-6 голов самцов и самок) с одинаковой массой тела. Испытуемые дозы препарата рассчитывают в мг на кг массы тела животного. Дозы эффек

194

ходят минимально токсическую дозу, которая не вызывает гибели (ЛД0). Отправным моментом для поиска доз могут служить известные данные

по острой токсичности аналогичных соединений. Далее увеличивают дозы пока одна из них не окажется достаточно высокой, чтобы вызвать гибель всех животных в группе (ЛД100). Интервал между дозами лучше увеличивать с постоянной кратностью.

На животных каждой группы испытывают одну отдельную дозу препарата. Продолжительность наблюдения за состоянием здоровья животных составляет не менее 21 дня после затравки. В этот период учитывают внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к пище и воде, подвижность, ритм и частоту дыхания и сердцебиения. Обращают внимание на время возникновения и характер интоксикации, оценивают ее тяжесть, обратимость определяют сроки гибели животных. Учитывают общее состояние и поведение животных (аппетит, возбуждение или угнетение), изменение реакции на внешние раздражители, определяют тактильную, болевую и температурную чувствительность, температуру и массу тела животных. Отмечают клинические симптомы интоксикации, количество заболевших и павших особей, сроки наступления их гибели.

Отработку летальных доз на каждом виде лабораторных животных следует проводить одновременно и в максимально короткие сроки (2-3 недели) при одинаковых условиях кормления и содержания.

Данные экспериментальных исследований в первоначальном варианте выражают в виде процента (%) летальных исходов, представляющего с бой отношение числа погибших особей в каждой группе к общему числу животных в группе, умноженное на 100. Для оценки токсического действия препаратов в токсикологии принято определять летальные или смертельные дозы (ЛД), представляющие собой количество вещества, вызывающее гибель определенного количества животных, выраженного в процентах. Различают ЛД0 (минимальную токсическую дозу), ЛД16, ЛД50 (среднесмертельную дозу), ЛД84 и ЛД100 (абсолютную смертельную дозу). Следует помнить, что ве

195

личины ЛД0 и ЛД100 не являются статическими и поэтому могут варьировать в значительных пределах.

Для расчетов параметров токсичности и среднесмертельной дозы используют графические и статистические методы анализа. Существуют методы расчета по Беренсу, Керберу и Першину.

Расчет среднесмертельной дозы на примере диаммоний-фосфата по Беренсу.

Группы	Масса,	Доза	Пало,	Выжило,	Накопленные
					частоты		% павших
	г	мг/кг	голов	голов
					пало	выжило
1	230	2000	0	10	0	35	0
2	230	3000	2	8	2	25	7,4
3	230	4000	4	6	6	17	26,0
4	230	5000	5	5	11	11	50,0
5	230	6000	6	4	17	6	73,0
6	230	7000	8	2	25	2	92,5
7	230	8000	10	0	35	0	100,0

Накопленные частоты вычисляются из суммы двух соседних цифр. Процент павших вычисляется из накопленных частот: сумма павших и выживших - за 100%, а число павших - х.

2 + 25 = 27 − 100%

2		− x%
x =	2 ×	100	= 7.4%

27

Из таблицы вычисляем по Беренсу ЛД50:

ЛД50	= А +	(50 − а) × d	, где
		Б − d

А - доза вызывающая а % смертельных исходов, причем а<50%; Б - процент дозы, вызывающий число летальных исходов больше 50%; d - интервал или разница между дозами.

196

	ЛД50 = 4000 +				(50 − 26) ×1000					= 4000 + 501 = 4501мг/кг
					73,9 − 28
ЛД50 можно вычислить и по Керберу:
			ЛД50 = ЛД100				−	∑(Z × D)			, где
								n
Z - средняя арифметическая из n особей у которых наблюдается
эффект (т.е. смежные - две цифры в графе «Пало, гол» складывается и
делится пополам).
d – интервал (разница) между дозами.
Например,
Дозы, мг	2000			3000			4000			5000			6000	7000	8000
Выжило, гол.	10			8			6			5			4	2	0
Пало, гол.	0			2			4			5			6	8	10
Z	0			1			3			4,5			5,5	7	9
D	1000			1000			1000			1000			1000	1000	1000
D×Z	0			1000			3000			4500			5500	7000	9000
ЛД = 8000−		1000+3000+ 4500+5500+ 7000+9000										= 8000−3000= 5000
50			10											(мг/кг)

ЛД50 = 5000 мг/кг Средняя ошибка средней дозы эффекта определяется по формуле:

MEd50 = K × E × d , где n

К- постоянный множитель – 0,66;

Е- основное отклонение, определяемое как, полуразность ½ × (ЛД84-

ЛД16);

d - интервал между дозами.

MEd50 = 0,66 ×1540 ×1000 = 101640 = ±318,6

10

ЛД16	= 3000 +		1000 ×	(16 − 7,4)	= 3000 + 462 = 3463 (мг/кг)
	16			− 7,4
ЛД84	= 6000 +	1000 × (84 − 73,9)				= 6000 + 543 = 6543 (мг/кг)
			92,5 − 73,9

197

ЛД50= 5000 ± 318,6

Т.о., средняя величина считается достоверной, если она превышает ошибку больше, чем в 3 раза.

Наряду со смертельной дозой устанавливают пороговую дозу - минимальное количество препарата, при котором наступает определенный статический достоверный сдвиг какого-нибудь чувствительного интегрального или специфического показателя у 50% опытных животных (например, понижение активности холинэстеразы). Расчет пороговой дозы проводят так же, как расчет ЛД50.

После определения величины ЛД50 и пороговой дозы вычисляют зону токсического действия, представляющую собой отношение ЛД50 к пороговой дозе. Чем меньше зона токсического действия, тем большую опасность может представлять собой данное вещество или препарат. Различают очень узкую зону (коэффициент меньше 6), узкую зону (коэффициент от 6 до 24) токсического действия.

Павших животных вскрывают и выявляют патологоанатомические изменения острой интоксикации препаратом. Проводят полное вскрытие, результаты фиксируются в протоколе. При необходимости проводят гистологические исследования с использованием гистохимики и электронной микроскопии.

На основании полученных данных исследуемый препарат классифицируется по токсичности (табл.16).

Таблица 16

Классификация химических веществ при однократном пути введения (по Л.И. Медведеву, 1964).

Класс	Обозначения	Величина ЛД50 при введе-
	токсичности вещества	нии через рот, мг/кг
1	Сильнодействующие	менее 50
2	Высоко токсичные	50	– 200
3	Средне токсичные	200	– 1000
4	Мало токсичные	больше 1000

198

Если препарат переносится животными без видимых последствий в дозе 20000 мг/кг и выше, количественная оценка его на токсичность не проводится, и он классифицируется как малотоксичный.

Дальнейшее исследование проводят по показаниям.

Изучение подострой и хронической токсичности. Целью изучения подострой токсичности является выявление избирательного влияния вещества, нефункциональное состояние отдельных органов, тканей и систем, а также его способность к кумуляции. Полученные в результате исследований данные могут быть использованы при разработке комплексной диагностики интоксикации.

Опыт выполняют не менее, чем на 2-х видах лабораторных животных наиболее чувствительных к данному препарату по результатам острого эксперимента. Продолжительность подострого опыта составляет от 10 (для препаратов, назначаемых одно-, двух-, трехкратно) до 45-90 дней (для препаратов с более продолжительным сроком применения).

Исходными данными для исследования хронического действия препарата служат результаты острого и подострого опытов. Целью хронического эксперимента является выявление отдаленных последствий применения химических веществ на животных и человека. Продолжительность хронических опытов составляет 9-12 месяцев.

Выяснение степени кумулятивного эффекта вещества указывает на возможность развития хронической интоксикации. При многократном поступлении в организм, вещество может накапливаться в нем непосредственно в исходном виде или в виде метаболитов (материальная кумуляция), либо вызывать суммирование патологических эффектов (функциональная кумуляция).

Исследования проводят на 1-2 видах лабораторных животных наиболее чувствительных к данному препарату.

При выборе доз и концентраций для проведения подострых и хронических экспериментов учитывают пороговую дозу и параметры острой токсичности препарата. Препарат задают ежедневно с кормом натощак в дозах 1/10,

199

1/20, и 1/50 ЛД50, установленных в остром опыте. Каждую дозу испытывают не менее чем на 10 крысах или мышах, 3-6 кроликах или кошках. Самцы и самки содержатся раздельно. В опытах с персональным введением препарата смешивают с кормом или вводят внутрь в соответствующих растворителях. Ввиду того, что животные, находясь в длительном опыте, могут подвергаться действию ряда побочных факторов, необходимо в тех же условиях содержать контрольную группу животных. Если подопытным животным вводят препарат в растворах с наполнителями, то контрольным необходимо вводить растворители или наполнители в соответствующих количествах.

Наблюдения за состоянием и поведением животных, временем и полнотой поедания корма осуществляют ежедневно. Взвешивание и клиническое обследование животных проводят до начала и затем через каждые 10 дней опыта. В подостром и хроническом экспериментах изучают в динамике специфические (если такие имеются) или интегральные показатели с привлечением гематологических, биохимических и гистологических методов исследования.

При оценке нового препарата, а также в случае выявления данных о его тропизме проводят исследования по фармако- и токсикодинамике, направленные на выяснение определенных сторон механизма действия на организм.

Степень кумуляции выражают в виде коэффициента, на основании которого определяют класс токсичности препарата.

Коэффицетн кумуляции препарата рассчитывают по формуле:

ЛД хрон.

Ккум = ЛД50 остр. , где

50

Ккум. - коэффициент кумуляции; ЛД50 хрон. – ЛД50, полученная при многократном введении препарата в

организм; ЛД50 остр. – ЛД50, полученная при однократном введении препарата в

организм;

200