токсикология

Среднесмертельную дозу (ЛД50 хрон.) получают в результате статистической обработки по аналогии с расчетом ЛД50 острого опыта. Данная формула используется в случае смертельных интоксикаций животных препаратом при проведении подострого (хронического) опыта.

Если при многократных затравках не отмечается случаев гибели живот-

ных, то расчёт производят по формуле :

=Суммарная_ доза

Ккум. ЛД50остр. , где

Ккум. - коэффициент кумуляции; суммарная доза - количество вещества, поступившие в организм в ре-

зультате многократного введения (ежедневно 1/10 ЛД50 в течение не менее 60 дней.);

ЛД50остр. - ЛД50, полученная при однократном введении.

Ускоренное определение кумулятивного эффекта (табл.17) проводят на 8-10 лабораторных животных. Препарат вводят рекомендуемым для практики способом.

				Таблица 17
	Ускоренное определение коэффициента кумуляции
			Дни введения
	Доза	1 - 4	5 - 8	9 -	15 -
				14	30
	Ежедневно вводимая доза в частях	0,4	0,15	0,3	0,5
	от однократной ЛД50
	Суммарная доза за 4 дня введения	0,4	0,6	1,2	0,5
	в частях от однократной ЛД50
	Суммарная доза по периодам вве-	0,4	1,0	2,2	9,7
	дения в частях от однократной ЛД50

Пероральная ежедневная доза должна составлять 1/10 от установленной ЛД50 в остром опыте и вводиться первые 4 дня. На 5-е сутки эту дозу увеличивают в 1,5 раза и вводят в последующие 4 дня. На 9-е сутки дозу повышают в 2 раза и вводят 6 дней. На 15-е сутки дозу доводят 1/5 ЛД50, получен

201

ную в остром опыте и вводят ее животным до выявления кумулятивного эффекта.

Оценка результатов исследования проводится по отношению средних летальных доз (ЛД50 хрон.) при многократном введении (n) и однократных (ЛД50 остр.) введениях:

К = ЛД50 хрон. , кум. ЛД50 остр.

где Ккум. - коэффициент кумуляции; ЛД50 хрон. - средняя летальная доза при многократном введений;

ЛД50 остр. - средняя летальная доза при однократном введении.

На основании полученных данных определяют класс токсичности вещества по степени кумуляции (табл.18).

В случае сверхкумуляции (коэффициент меньше 1) внедрение препарата в практику ветеринарии и животноводства становится невозможным и его дальнейшее изучение прекращается.

			Таблица 18
	Классификация химических веществ по степени кумуляции
	(по Л.Н. Медведю, 1964)
	Кумуляция		Значение Кк
1	Сильно выраженная		Меньше 1
2	Выраженная		1-3
3	Умеренная		3-5
4	Слабо выраженная		Больше 5

Примечание: Ккум.>1 свидетельствует о развитии повышенной резистентности к изучаемым препаратам, Ккум.<1 свидетельствует о наличии кумулятивных свойств.

Изучение аллергенных и раздражающих свойств. Аллергенные свойства препарата изучают в том случае, если для этого есть основания в виде местного и раздражающего действия, выявление при испытании острой, подострой и хронической токсичности.

Для опытов используют несенсибилизированных животных. Местное и раздражающее действие препаратов изучают на морских свинках и кроликах

202

при одно- и многократном нанесении препарата на кожу и слизистые оболочки. При этом учитывают концентрацию препарата.

Наиболее простым в исполнении и достаточно объективными тестами могут быть "провокационные пробы". Процесс аллергизации химическими препаратами при их парантеральном введении активнее всего проявляется при соблюдении следующих условий:

−при 3-5 разовом поступлении аллергена;

−при введении аллергена с интервалом 3-5-7 дней;

−при соблюдении инкубационного периода продолжительностью не менее 14 дней;

−при количественном превышении разрешающей дозы аллергена над его суммарной дозой, используемой для сенсибилизации животного;

−при доведении общей длительности воспроизведения аллергического состояния до 30-40 дней.

Многократное, ежедневное введение препарата одними и теми же путями без соблюдения прерывистости приводит к преимущественному проявлению токсического эффекта.

Испытание аллергенных и раздражающих свойств проводят параллельно с подострым и хроническим опытами.

Воспроизведение анафилактического шока проводят с целью установ-

ления раздражающей дозы аллергена.

Морских свинок сенсибилизируют 5 инъекциями с 3-5-7-дневными промежутками. Интервалы подбирают так, чтобы общее количество дней на сенсибилизацию вместе с инкубационным сроком (14-21 день) составило 3040 дней.

Сцелью сенсибилизации организма подкожно вводят гаптены: лошадиную сыворотку по 0,3 мл 0,1-0,5 % раствор бихромата калия по 0,1-1,0 мл, сульфанол НП-1 и другие.

Расчеты доз и концентраций ведут с учетом методики применения препарата, веса и продолжительности эксплуатации животного. Величина разре-

203

шающей дозы должна быть равной или несколько превышать суммарную дозу, взятую для сенсибилизации. Концентрация раствора остается такой же, как при сенсибилизации.

При внутрисердечном методе введения симптомы анафилактического шока проявляются очень быстро в течение нескольких минут. Внутрибрюшинная или подкожная разрешающая инъекция вызывает ослабленную или затяжную реакцию.

Оценка аллергенных свойств препарата: легкая форма, шок средней тяжести, тяжелая форма шока и шок со смертельным исходом.

Метод накожных аппликаций. Сенсибилизацию проводят много кратными аппликациями данного препарата (15-30) на один и тот же участок кожи в концентрациях, установленных для воспроизведения анафилактического шока. Об аллергенных свойствах препарата судят по развитию выраженного дерматита.

На выстриженный участок кожи размером 1,5×2 или 2×3 см наносят водный, спиртовой или ацетоновый раствор препарата, эмульсии либо мази на вазелиновой основе (0,1 мл на ч.), которую затем удаляют. При постановке капельных проб у морских свинок развивается аллергическая реакция замедленного типа, достигшая максимума через каждые 48-72 часа. В этой связи следует учитывать реакции каждые 24 часа. При наличии аллергенных свойств препарата на месте аппликации развивается эритема, отек кожи, геморрагии или некроз.

Для изучения раздражающего действия препаратов существует ряд методов.

Метод конъюнктивальных проб. Для его постановки одну каплю водного раствора вводят глазной пипеткой под верхнее веко морской свинке или кролику, а во второй глаз (контроль) - 1 каплю воды. Реакцию учитывают дважды: через 5 мин и спустя 24-48 ч. по покраснению конъюнктивы и по реакции склеры. Возможно развитие зуда (расчесывание лапками), острого офтальмита, истончения эпителия роговицы, набухание сосудов, отек конъюнк

204

тивы, дегенерация, лейкоцитарная реакция. При выраженном действии возможны ожоги 1,2, и 3 степени.

Метод погружения хвоста. Белых мышей или крыс фиксируют в специальных станках, изготовленных для данных целей. Погружение хвоста производят на 1/3 его длинны в растворы препарата различной концентрации. Учет производят по гиперемии, отеку и некрозу кожи хвоста, а также общей реакции со стороны организма.

Метод окраски с трепановым синим. Кролика фиксируют в спинном положении, на животе выстригают 6 полей 10×15 мм каждое. Кожу обезжиривают спиртом и наносят (втирают) препарат в необходимых количествах и концентрации (или различные препараты). На 2 поля наносят растворители препарата. Поверхность полей прикрывают марлевым тампоном, полиэтиленовой пленкой и фланелью (полотенцем). Через 15 мин кролику внутривенно вводят 1% раствор трипанового синего в дозе 1 мл/кг. Реакцию учитывают через 3-5 часов после нанесения препарата (равномерное окрашивание препарата - выраженного раздражающего действия, различимая голубая окраска - умеренного действия, слабо различимое голубое окрашивание - слабого действия, окраски нет - раздражающий эффект отсутствует).

Нанесение препаратов на кожу в виде растворов, эмульсий, суспензий и мазей производят на выстриженную (выбритую) и обезжиренную поверхность одно- и многократно.

По степени аллергизации препараты делятся на:

1) сильные аллергены дают не менее 80% случаев реакций с быстрым развитием и выраженным проявлением клинико-морфологических проявлений;

2) средней силы аллергены вызывают у 50-80% животных положительную реакцию;

3) слабые аллергены - положительная реакция отмечается у животных менее 50% при слабом ее течение и отсутствии клинико-морфологических изменений.

205

При оценке кожной реакции пользуются следующей шкалой в баллах: 0 - видимой реакции нет; 1 - очаговая эритема по всему участку нанесения кашш, аппликация

хвоста; 2- сплошное бледно-розовое пятно или сливающаяся очаговая эритема

(красные пятна на розовом фоне);

3- сплошная эритема с ярко-розовым или красным цветом кожи;

4- инфильтрация и отёк кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы;

5- эритема, выраженная инфильтрация, образование корочек.

Слабые, плохо проникающие через кожу аллергены, чаще вызывают очаговую эритему, а хорошо всасывающиеся - сплошную.

Инфильтрация и отёк развиваются при интенсивной сенсибилизации, а ответная реакция в 5 баллов возникает при гиперергичееких реакциях.

При постановке конъюнктивальных проб реакцию оценивают по следующей шкале:

1- легкое покраснение слезного протока;

2- покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;

3- покраснение всей конъюнктивы и склеры.

При отнесении препарата к сильным аллергенным, дальнейшие исследования его прекращают и делают заключение о нецелесообразности его применения в практике животноводства.

В тех случаях, когда исследуемое вещество является слабым или средним аллергеном это учитывают при разработке его лечебных и профилактических доз.

Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств. Эмбриоток-

сические и тератогенные свойства изучают параллельно в 2-3 сериях опытов на белых крысах в плодном, неонатальном и постнатальном периодах. При показаниях проводят дополнительные исследования на морских свинках и

206

кроликах. Основной целью исследований является оценка степени влияния вещества или препарата на продуктивную функцию организма.

В первой серии опытов определяют влияние препарата при однократных воздействиях. С этой целью 30-40 интактных половозрелых самок белых крыс массой 180-200 г спаривают с самцами из расчёта посадки одного самца к 2-3 самкам. Начало беременности устанавливают по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке. После этого самцов отсаживают.

Беременным самкам препарат вводят тем способом, который рекомендуется для его применения, в максимально переносимых дозах, не вызывающих гибели животных, однократно 10-и самкам на 5 (период имплантации) и 10 - на 10(период органогенеза) дни беременности. Дозы подбирают экспериментально на основании данных острой токсичности. Животным контрольной группы (5 особей) вводят в том же объёме вводы. За животными ведут ежедневное наблюдение.

Половина самок убивают декапитацией на 20-й день беременности, то есть непосредственно перед родами вскрывают и проводят учёт по следующим показателям: общая плодовитость, количество жёлтых тел беременности, живых и мёртвых эмбрионов. По формулам, предложенным А.М. Малашенко и И.К.Егоровым (1967г.) подсчитывают раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность.

Расчет ранней и поздней резорбции и эмбриональной смертности производят по следующим формулам (А.М.Малашенко, И.К.Егоров, 1967):

Общая эмбриональная смертность = B − A ×100,

				B
	Смертность до имплантации =	B − (A + B)				×100 ,
			B
	Смертность после имплантации =		Б		×100 ,
			А + Б

Выживаемость = АБ ×100 ,

где А - число живых эмбрионов;

207

Б - число мертвых эмбрионов; В - количество жёлтых тел беременности.

Уродства плодов классифицируют:

-анэнцефалия - отсутствие головного мозга;

-микроцефалия - недоразвитие головного мозга; гидроцефалия - водянка головного мозга;

-энцефалоцелия - мозговая грыжа;

-спина бифида - расщепление нервных дужек позвонков;

-анофтальмия - отсутствие глаз;

-микрофтальмия - недоразвитие глаз;

-циклопия - одноглазие;

-заячья губа, волчья пасть;

-микрогнатия - недоразвитие челюстей;

-мегалокон - увеличение кишечника;

-гепатотомегалия - увеличение печени;

-дивертикулы - выпячиваниестенки полого органа, сообщающееся с его полостью;

-неправильное положение органов;

-экардия - отсутствие сердца;

-гемикрания - отсутствие черепной крышки;

-амелия - полное отсутствие конечностей;

-перамелия - укорочение конечностей;

-увеличение или уменьшение числа пальцев;

-редукция задней части туловища;

-отсутствие, укорочение или деформация хвоста.

Внешним осмотром плодов отмечают отклонения от нормального развития, уродства и классифицируют их.

Результаты исследования на эмбриотоксичность заносят в таблицу 19. Другую часть самок (5-10 опытных и 5 контрольных) оставляют до на-

ступления естественных родов. Наблюдения за молодняком продолжают в

208

течение 30-60 дней, каждые 5-7 дней производят взвешивание и обмер крысят, оценивают степень их физического развития (время отлипания ушей, прорезывание глаз и зубов, развитие шерстного покрова и т.д.).

Во второй серии опытов определяют многократное влияние подострых доз препаратов. Берут 4 группы опытных лабораторных животных (по 2 группы самок и самцов) и 2 -контрольные (самцов и самок) по 12 особей в каждой группе. Препарат вскармливают в течение 6-9 месяцев в дозах, превышающих рекомендуемую в 3-5 раз, соответственно самцам и самкам. Контрольные крысы содержатся в тех же условиях, что и опытные, но препарат не получают.

По истечению опытного периода проводят индивидуальное спаривание

вследующих вариантах:

1)контрольных самцов с опытными самками (6×6 голов);

2)контрольных самок с опытными самцами (6×6 голов);

3)опытных самок с опытными самцами (6×6 голов).

4)контрольных самок с контрольными самцами (6×6 голов).

Таблица 19 Результаты эмбриотоксического исследования препарата:

Показатели

опыт/доза

Контроль

1. Путь введения препарата

2.Вскрытие на 20-й день беременности: а) количество беременных самок; б) среднее количество желтых тел на од-

ну самку; в) нормальных зародышей всего (А),

%

3. Рождение в срок:

а) число родивших самок; б) число новорождённых;

в) рождённых живыми всего (В); г) средняя масса при рождеии; д) средняя длина туловища (мм) е) макроскопические особенности

209

4.Исход беременности:

а) благоприятный, всего особей (Д+В); б) неблагоприятный, всего особей (В+Д)

Беременность устанавливают по наличию сперматозоидов в мазках влагалищной слизи. Отмечают возможные отклонения в оплодотворяющей способности. При отсутствии оплодотворения спаривание повторяют.

Учитывают клиническое состояние самок в период беременности, родов и после них, выживаемость и характер постэмбриального развития крысят по каждому из вариантов.

Изучение канцерогенных и мутагенных свойств препаратов проводят в специализированных токсикологических лабораториях.

Разработка метода, определения остаточных количеств препара-

тов. Одним из условий представления материалов на препарат является определение его остаточных количеств в кормах, патологическом материале и продуктах животноводства (молоке, яйце, мясе).

Разработка метода индикации препарата, его действующего начала или компонентов производится на основе существующих в настоящее время стандартных аналитических систем, включающих различные физико-хими- ческие методы исследования. Наиболее перспективными из них являются оптический (фотоколориметрический, нефелометрический, люминесцентный, атомно-адсорбционный спектральный анализ), хромотографический (на бумаге и в тонком слое, газовый и газожидкостный), ионометрический (метод ионоселективных электродов) и некоторые другие.

Используемый метод должен быть количественным, достаточно чувствительным (открываемый минимум для тонкослойной хроматографии 0,2 мг/кг, для газожидкостной 0,02 мг/кг), по возможности специфичным и легко воспроизводимым.

Особое внимание следует уделять способу изолирования (экстракции и очистке) изучаемого препарата (вещества) из биологического материала и отделения его от присутствия мешающих определению веществ.

210