6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

–Централизация лабораторной службы (цель – контроль над мониторингом)

–Соблюдение стандартных лабораторных технологий и инфекционный контроль

–Квалифицированные кадры

–Административная поддержка

Критерий внешней оценки качества работы центральной территориальной лаборатории ПТУ:

Эффективность тестов ЛЧ (процент правильных определений на основе международной тест-панели): R, H – 95%; S E – 85%

Алгоритм получения репрезентативных данных по территории:

–Общие данные: региона, по районам, кластеризация, рандомизация

–Основные эпидемиологические показатели: региона, по районам

–Объем репрезентативной выборки культур МБТ по территориям из расчета минимальной ожидаемой частоты распространения ЛЧ по территории: (мин. МЛУ – 3%)

Мониторинг качества тестов на ЛЧ в региональных лабораториях:

– Впервые выявленный случай:

o25% лекарственно-устойчивых культур

o10% чувствительных культур

–Ранее леченый случай:

o10% устойчивых культур

o10% чувствительных культур

Минимально необходимые компоненты формы мониторинга:

– Регистрационная форма:

oКлиническая

oОрганизационно-методическая

oЛабораторная

–Отчетная форма:

oСпектр устойчивости

oВ/выявленные

oРецидивы

oДр. ранее леченые случаи

Анализ результатов мониторинга: показатели распространения ЛУ туберкулеза должны сопровождаться интервалом достоверности и точности исследований.

288

Ситуационная задача

В качестве задачи предлагается рассмотреть несколько конкретных примеров проведенного мониторинга распространения туберкулеза с МЛУ и сделать комментарии (табл. 1).

Табл. 1

Аппроксимация распространения МЛУ туберкулеза на основе разных методов

	В/В больные			Ранее леченные
Территории	Абс.	Точность	Точность	Абс.	Точность	Точность
	конц., %.	Абс.	«Био-	конц.,%	Абс.	«Био-
		конц,%	чип»,%		конц,%	чип»,%
Ивановская	4,8	95	74	58,1	95	82
Владимирская	10,6	96	86	38,6	77	63
Чувашия	15,0	96	86	70,6	82	70

Комментарии к задаче

–Подтвержден эпидемически значимый уровень распространения лекарственно-устойчивого туберкулеза, включая МЛУ, среди впервые выявленных больных и сверхвысокое значение этого показателя среди ранее леченных;

–Показатели распространения ЛУ туберкулеза должны сопровождаться интервалом достоверности и точности исследований

–Метод абсолютных концентраций определения ЛЧ МБТ по точности и надежности получения результатов является достаточным для получения корректных и гармонизированных с международными исследованиями данных

–Выявлены региональные особенности распространения туберкулеза с МЛУ среди впервые выявленных больных.

–Из чего следует: для оценки эффективности противотуберкулезных программ приоритетным является региональная оценка показателей распространения ЛУ туберкулеза

Заключительная часть (5 мин)

Подводя итог, обращается внимание участников семинара на значение и необходимости ведения территориального мониторинга распространения туберкулеза с ЛЧ для постоянного контроля (в том числе, качества исследований и сбора информации) и прогнозирования тенденций распространения, отражающего эффективность территориальной противотуберкулезной программы в целом.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

289

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуемая литература

1.Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.М. Компоненты мониторинга лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза для оценки эффективности национальной программы противотуберкулезной помощи населению // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2001. – №2. – С.18–20.

2.Попов С.А., Дорожкова И.Р. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в отдельных территориях России за 1979–1998 гг. // Проблемы туберкулеза. – 2000. – №5. – С. 19–22.

3.Попов С.А., Пузанов В.А., Сабгайда Т.П. Проблемы мониторинга туберкулёза с лекарственной устойчивостью в РФ. Оценка результатов первого цикла мониторинга // Туберкулез и болезни легких. – 2011. – № 10. – C. 16–21.

4.Попов С.А., Пузанов В.А., Сабгайда Т.П., Богородская ЕМ. Мониторинг лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в регионах Российской Федерации. Информационное письмо № 10-11/06-6013 от 18 мая 2007 // Росздрав. – 2008. – 8 с.

5.Попов С.А., Сабгайда Т.П. Достоверность эпидемиологических показателей лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза/ Социальные аспекты здоровья населения // Электронный научный журнал. – 02.06.2009 г. – http://vestnik.mednet.ru/content/view/126/30/lang,ru/

6.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

7.Laboratory services in tuberculosis control. Part I: Organization and management. – 1998. – 64 pp.

8.Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Second edition. WHO. – Geneva. – 2003 (WHO/CDS/TB/2003.320). – 71p.

9.Guidelines for Surveillance of Drug Resistance in Tuberculosis, WHO/CDS/TB/2003. – Geneva, 2003. – 320 pp.

10.Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB). 2010 global report on surveillance and response. Geneva, World Health Organization, 2010 (WHO/HTM/TB/2010.3)

Материально-техническое обеспечение

Флип-чарт, маркеры, фломастеры, скотч, ножницы, бумага А4, раздаточные материалы (ситуационные задачи, др. материалы), мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка.

290

МОДУЛЬ 5. Методы выявления возбудителя туберкулеза

иопределения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных

иполуавтоматизированных систем

Тема 5.1. «Пробоподготовка, особенности культивирования, выделения и идентификации культур на автоматизированных и полуавтоматизированных системах»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•устройства автоматизированных и полуавтоматизированных систем, принципы работы и регистрации роста микроорганизмов;

•характеристики устройств, требования к обеспечению их работоспособности;

•подготовка реактивов и реагентов для пробоподготовки;

•лабораторные процедуры пробоподготовки;

•особенности пробоподготовки различных диагностических материалов;

•стерильность материалов и причины контаминации;

•культивирование в системе BACTEC MGIT 960;

•идентификация культур

Цель семинара – формирование у слушателей представления о стандартных лабораторных процедурах касающихся пробоподготовки диагностических материалов для использования на автоматизированных системах в общем алгоритме работы.

Семинар проводится в интерактивной форме. Разбираются значение мониторинга, принципы его реализации, перечень необходимой документации, взаимодействие с другими структурами ЛПУ и учреждениями. Даются лабораторные ситуационные задачи. При планировании семинара необходимо учесть целевую аудиторию, их уровень подготовленности и опыт работы, самостоятельную подготовку к семинару.

Вводная часть (5–10 мин)

Ведущий семинара обсуждает со слушателями основные принципы работы BACTEC MGIT 960 и регистрации роста микроорганизмов, характеристики устройства, требования к обеспечению их работоспособности.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

291

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Основная часть (30 мин)

Полностью лабораторные процедуры изложены в Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

В ходе семинара обсуждаются следующие темы:

Пробоподготовка

1.Универсальность

2.Кросс-контаминация

3.Оборудование

4.Реагенты

Культивирование, регистрация

1.Позитивные результаты

2.Негативные результаты

3.Контаминация

4.Смешанная культура

Контрольные процедуры

1.Микроскопия

2.Агаровые среды

3.Плотные среды

Идентификация выделенных культур

1.Микроскопия световая

2.Иммунохроматографический тест

3.Культуральная идентификация на плотных питательных средах: PNB, NaSal.

Ситуационная задача

Перечислить виды диагностических материалов, которые не рекомендуется исследовать в системе BACTEC MGIT 960. Объяснить причины этого.

Комментарии к задаче

Не рекомендуется исследовать следующие виды материалов: моча, кровь, кровь-содержащие материалы, негомогенизированные плотные биоптаты. Основными причинами ограничений исследования мочи – высокий процент контаминации при использовании рекомендованного метода обработки; кровь не используется по причине возможного снижения парциального давления кислорода в пробирке MGIT и получения ложно-поло- жительного результата; негомогенизированные плотные биоптаты не используются по причинам – трудностей деконтаминации

292

плотных материалов, а также трудностей идентификации культуры, выросшей внутри плотной массы.

Заключительная часть (5 мин)

Для закрепления необходимо кратко перечислить основные моменты пробоподготовки материалов для использования в системе культивирования BACTEC MGIT 960. Следует помнить об ограничениях используемых технологий и высокого риска контаминации при отступлении от правил пробоподготовки диагностических материалов.

Рекомендуемая литература

1.Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 г. №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации», Приложение 11.

2.Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

3.Kent P.T., Kubica G.P. Public health mycobacteriology: guide for the level III laboratory. Atlanta, GA, USA: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control. – 1985. – P. 57–63.

4.Recommendations from CDC and the Association of Public Health Laboratories Task Force on Tuberculosis Laboratory.

5.Siddiqi S.H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.

6.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.

7.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

293

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Тема 5.3. «Внутренний и внешний контроль качества при проведении исследований на автоматизированных и полуавтоматизированных системах»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план семинарского занятия

Вопросы, прорабатываемые на семинаре:

•понятие о внутреннем и внешнем контроле качества при проведении исследований на автоматизированных и полуавтоматизированных системах;

•механизм реализации внутреннего контроля качества;

•механизм реализации внешнего контроля качества и Федеральный контроль качества.

Цель семинара – формирование у слушателей представлений

об основных правилах контроля качества при проведении исследований на автоматизированных и полуавтоматизированных системах

Семинар проводится в интерактивной форме. Разбираются значение контроля качества, принципы его реализации, перечень необходимой документации, взаимодействие с другими структурами ЛПУ и учреждениями. Даются лабораторные ситуационные задачи. При планировании семинара необходимо учесть целевую аудиторию, уровень подготовленности и опыт работы, самостоятельную подготовку к семинару.

Вводная часть (5–10 мин)

В водной части освещаются ограничения и недостатки автоматизированных систем, высокая зависимость результатов исследований от технической исправности оборудования, бесперебойности питания и т.д. В частности следует обратить внимание на вопросы:

•невозможности наблюдения структуры и окрашивания колонии в жидкой среде;

•контаминация может скрыть рост микобактерий;

•невозможность прямой количественной оценки роста МБТ: положительную культуру из клинической пробы не всегда воз-

можно соотнести с КОЕ, присутствующими в пробе. Пробирка MGIT, кажущаяся положительной, может содержать

смесь культур более одного вида микобактерий. Микобактерии с более быстрым ростом могут вызвать флюоресценцию раньше медленнорастущих микобактерий. Поэтому в случае признаков наличия более одного вида микобактерий, большую роль играет суб-

294

культивирование положительной пробирки MGIT на плотных питательных средах.

Иногда высокая конечная рН пробы может вызвать ложную кратковременную флюоресценцию датчика.

Смесь антибиотиков PANTA, необходимая для подавления контаминирующих бактерий, может также оказывать ингибирующий эффект на некоторые виды микобактерий помимо комплекса М.tuberculosis. Подобное ингибирование различно у разных видов бактерий и происходит в рамках одного вида. Однако общее выделение нетуберкулезных бактерий достигается на более высоком уровне в жидкой среде, нежели в плотной.

Флюоресценция измеряется по отношению к контрольным пробиркам, которые со временем утрачивают свою флюоресценцию, а также зависит от профилактики сенсоров прибора.

Все эти положения требуют тщательного выполнения требований внутреннего контроля и внешней оценки качества исследований.

Основная часть (30 мин)

При выполнении работ на автоматизированных системах необходимо использовать все меры контроля качества: организацион-

ные методы, контроль всех технологических этапов исследований, лабораторные методы (тест-системы). Предполагают использование положительных и отрицательных контрольных образцов, статистические методы. Еженедельный и ежемесячный анализ и обобщение данных: выяснение статистических отклонений от средних показателей частоты положительных результатов, эффективность диагностического обследования пациентов, показатель выявляемости бактериовыделителей, доля контаминации образцов т.д.

Обеспечение качества оборудования и воздушной среды. В связи с высоким риском контаминации и кросс-контаминации образцов все процедуры следует проводить только в шкафах биологической безопасности II класса защиты. Перед удалением из лаборатории отработанных материалов, последние следует обеззараживать посредством автоклавирования. Следуйте мерам безопасности согласно протоколам исследований производителя, а также общелабораторным правилам биологической безопасности.

Контроль качества микроскопии на КУМ. Обычно внутренний контроль качества осуществляется только с набором самостоятельно приготовленных и окрашенных мазков. Однако для прове-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

295

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

дения внутреннего контроля качества рекомендуется использовать и неокрашенные образцы: положительный и отрицательный.

Производитель рекомендует использовать мазки из положительных культур M.tuberculosis (H37Rv, № 27294 по АТСС – Американской коллекции типовых культур или H37Ra АТСС 21577); для положительного контроля также можно использовать НТМБ. Для выполнения положительного мазка необходимо использовать суспензию, мутность которой эквивалентна стандартам мутности McFarland № 0,5–1,0. Также можно использовать мазки из культуры, выращенной на плотной среде. Для отрицательного контроля можно использовать бактериальные суспензии, например Е. coli. Все контрольные образцы необходимо проанализировать до того, как будут обследованы препараты для микроскопии, взятые из клинических проб. На положительном контроле должно быть видно четкое окрашивание КУМ, при этом на отрицательном контроле КУМ не должно быть. Некоторые микобактерии, не входящие в комплекс M.tuberculosis, особенно быстрорастущие бактерии, легко обесцвечиваются и могут слабо реагировать на окрашивание.

Контроль качества пробирок MGIT. Необходимо проводить не только визуальный контроль качества содержимого каждой новой партии пробирок MGIT и обогатительных добавок при их получении и перед обычным использованием, но и лабораторный.

Рекомендуется использовать эталонные штаммы: M.tuberculosis, H37Rv ATCC 27294; M.kansasii ATCC 12478; M.fortuitum ATCC 6841. Рост на плотных питательных средах этих штаммов должен проявиться в течение 10–15 дней (кроме быстрорастущего M.fortuitum) после начала субкультивирования. Долго хранящиеся культуры не смогут обеспечить надежных результатов.

Подготовка суспензий штаммов для контроля качества и контроль их роста.

Для контроля качества необходима правильная подготовка рабочей суспензии одного из контрольных МБТ штаммов по стандарту McFarland № 0,5 (свежеприготовленную или замороженную, в соотношении 1:5). Далее суспензию разводят еще два раза в соотношении 1:10. Далее делают разведения до конечного соотношения 1:500. Если контрольный штамм M.fortuitum, дальнейшее разведение выполняют до 1:5000. Если контрольный штамм М. kansasii, следует выполнить разведение до 1:50000.

После установки в прибор BACTEC MGIT 960 пробирки извлекают после того, как на приборе отобразится положительная

296

индикация. Данные регистрируют по времени, необходимому для определения положительных проб. В этих разведениях положительная флюоресценция наступает для M.tuberculosis через 6–10 дней, M.kansasii через 7–10 дней и для M.fortuitum через 1–3 дня.

В случае несоблюдения указанных критериев тест повторяют. Если тесты контроля качества не дают положительных результатов, проверяют жизнеспособность инокулята, возраст культуры (если она хранилась в замороженном состоянии) и другие аспекты процедуры.

Контроль качества методик лабораторных исследований. Необходимо регулярно выполнять контроль качества всех используемых ре агентов, таких как NaOH-NALC и буфер, а также процедур, применяемых в лаборатории. Для контроля контаминации рекомендуется включать в набор обрабатываемых проб отрицательный образец. Эту процедуру можно выполнять раз в день или в неделю. Также для мониторинга скорости роста тестируемого при контроле качества, можно периодически задействовать положительный клинический образец.

Положительные и отрицательные образцы для контроля. В качестве отрицательного образца используется 5 мл фосфатного буфера, а для положительного контроля – 5 мл суспензии M.tuberculosis (мутность по стандарту McFarland № 0,5), разведенной в пропорции 1:500 (см. процедуру контроля качества). Отрицательные и положительные образцы обрабатываются вместе с клиническими пробами, используя те же самые способы разжижения, деконтаминации и концентрации. Если в отрицательном образце заметна положительная флюоресценция, проверьте его на наличие бактерий и микобактерий в нем. Если замечен положительный рост, проверяют этапы исследования и все реагенты на наличие возможного источника контаминации.

Статистический контроль качества (по лабораторным данным).

Для проведения этого вида контроля качества следует осуществлять периодический ежеквартальный анализ получаемых результатов. В частности, следует контролировать соотношение следующих индикаторов:

•Положительный результат микроскопии – положительный результат культуральной диагностики; общее количество исследований; среднее время роста культуры до получения результата.

•Отрицательный результат микроскопии – положительный результат культуральной диагностики; общее количество иссле-

Раздел 2. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К СЕМИНАРАМ

297