- •Российский университет дружбы народов
- •К практическим занятиям по биохимии
- •Авторский коллектив:
- •Предисловие как пользоваться этим учебным пособием?
- •Список сокращений и условных обозначений
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •1. Общие требования безопасности
- •Классификация химических реактивов в биохимической лаборатории
- •2. Требования безопасности перед началом работ
- •3. Требования безопасности во время работы
- •4. Требование безопасности в аварийных ситуациях
- •5.Требование безопасности по окончании работы
- •Раздел 1: Аминокислоты и простые белки Введение
- •1.1 Проверка знаний по органической химии
- •1.2. Цветные реакции на белки и аминокислоты. Реакции осаждения и денатурации белков а. Цветные реакции на белки и аминокислоты
- •Б. Реакции осаждения и денатурации белков
- •1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых
- •1 .4. Диализ белков. Бумажная хроматография аминокислот
- •А. Диализ
- •1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»
- •Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты Введение
- •2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы а. Действие амилазы на крахмал
- •Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции
- •2.2. Количественное определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови с п-нитрофенилфосфатом
- •2.3. Коллоквиум II по теме: «Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Варианты заданий на компьютерном тестировании
- •Правильные ответы
- •Раздел 3: Витамины, липиды, гормоны Введение
- •3.1. Количественное определение витаминов с и р.
- •3.3. Влияние гормонов на содержание глюкозы в крови
- •3.4. Коллоквиум III по теме «Витамины, липиды, гормоны»
- •Раздел 4: Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов Введение
- •4.1. Специфичность действия ферментов распада углеводов: амилазы и сахаразы
- •4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
- •4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
- •4.4 Коллоквиум IV по теме: «Метаболизм. Биоэнергетика клеток. Химия и обмен углеводов»
- •Правильные ответы
- •Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция Введение
- •5.1. Кинетика действия липазы.
- •5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору
- •I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.
- •II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.
- •5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови
- •5.4. Количественное определение малонового диальдегида
- •5.5. Коллоквиум по теме «Обмен липидов»
- •Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот
- •6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.
- •6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
- •6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАт) методом бумажной хроматографии
- •6.4. Экспресс-метод определения повышенного содержания фенилаланина в плазме крови
- •6.5. Количественное определение мочевины в моче ферментативным уреазным/фенол-гипохлоритным методом
- •6.6. Количественное определение креатинина в моче
- •6.7. Коллоквиум по теме: «Обмен простых белков» Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. Введение
- •7.1. Определение общего билирубина в сыворотке крови
- •7.2. Количественное определение мочевой кислоты в моче
- •7.3. А. Определение активности -амилазы в моче
- •7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии
- •7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови
- •7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
- •7.6. Коллоквиум по теме: «Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белка». Вопросы, для самостоятельной подготовки
- •Варианты письменной части коллоквиума
- •Правильные ответы
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену
- •8.1. Основные вопросы, выносимые на обсуждение
- •8.2. Пример экзаменационного тестового задания по курсу биохимии
- •59. Найти соответствие между процессом и его графическим изображением
- •60. Цикл мочевинообразования установил
- •Ответы к экзаменационному тесту
- •Раздел 9: Приложения
- •9.1. Термины, различающиеся по смыслу, но сходные по написанию и звучанию
- •9.2. Стандартные биохимические наборы и реактивы, используемые в практикуме
- •9.3. Рекомендуемая литература
- •Содержание
- •Раздел 7: Обмен хромопротеинов и нуклеопротеинов. Биохимия крови и мочи. Биосинтез нуклеиновых кислот и белков. 126
- •Раздел 8: Подготовка к экзамену 148
- •Раздел 9: Приложения 161
4.2. Количественное определение глюкозы. Построение «сахарных кривых»
А. Ферментативный метод количественного определения глюкозы в сыворотке или в плазме крови
Количественное определение глюкозы в крови является одним из основных методов диагностики нарушений углеводного обмена.
Клинико-диагностическое значение
Повышение концентрации глюкозы в сыворотке крови (гипергликемия) наблюдается чаще всего при недостаточной секреции инсулина, а также при гиперфункции щитовидной железы и гиперсекреции гормонов, в частности, при опухолях коркового слоя надпочечников и опухолях гипофиза.
Гипогликемия может наблюдаться при гипофункции щитовидной железы, гипофизарной кахексии, Аддисоновой болезни, аденоме поджелудочной железы, а также может быть вызвана голоданием, продолжительной физической работой или передозировкой инсулина.
Цель работы
Определить содержание глюкозы в исследуемой сыворотке крови ферментативным методом и сравнить полученные результаты с нормальными величинами.
Принцип метода
Глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии высокоспецифичного фермента глюкозооксидазы с образованием пероксида водорода. Затем пероксид водорода в присутствии фермента пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом. В результате образуется окрашенное соединение, оптическая плотность которого при 510 нм пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце.
Выполнение работы (см. приложение)
Реагенты |
Опыт |
Стандарт |
Контроль |
Глюкозный реактив*, мл |
3 |
3 |
3 |
Сыворотка крови, мл |
0,02 |
— |
— |
Стандартный раствор глюкозы (10 ммоль/л), мл |
— |
0,02 |
— |
Н2О, мл |
|
|
0,02 |
Пробы перемешивают и инкубируют 15 мин при температуре 37°С |
|||
Фотометрируют против Н2О ( = 510 нм, толщина кюветы 0,5 см). D510 |
|
|
|
Dоп – Dк |
|
|
|
* 4-аминоантипирин, п-гидроксибензолсульфонат, пероксидаза и глюкозооксидаза, фосфатный буфер (pH 8,0)
Расчет содержания глюкозы в сыворотке крови(моль/л):
Норма: для сыворотки и плазмы крови 3,9 – 6,1 ммоль/л, для цельной крови 3,3-5,5 ммоль/л.
Выводы
Б. Определение глюкозы в крови с помощью глюкометра (демонстрация)
Принцип ферментативного определения глюкозы положен в основу многочисленных автоматических глюкометров, которые выпускаются в комплекте с электрохимическими тест-полосками однократного использования.
Определение концентрации глюкозы в крови осуществляют после нанесения пробы крови на полоску, подключенную к прибору. Прибор обнаруживает пробу крови, определяет концентрацию глюкозы и выводит показания на экран. Прибор может применяться в клинической практике при недоступности лабораторных методов измерения, при скрининговых исследованиях, в полевых условиях и чрезвычайных ситуациях, а также для индивидуального использования с целью постояного контроля за уровнем глюкозы в крови у больных сахарным диабнтом.
В. Оральный глюкозотолерантный тест (синонимы: тест толерантности к глюкозе, реакция организма на сахарную нагрузку)
У здорового человека однократный прием 50-100 г глюкозы вызывает временное повышение ее содержания в крови – пищевую или алиментарную гипергликемию. Эта гипергликемия обусловлена тем, что при поступлении сразу большого количества глюкозы печень не успевает утилизировать ее полностью, и часть глюкозы поступает в кровь. Повышение содержания глюкозы в крови вызывает выделение инсулина, который нормализует ее содержание в крови уже через 1,5-2 часа. Обычно выделяется избыточное количество инсулина, и уровень глюкозы опускается даже несколько ниже нормы. При инсулиновой недостаточности содержание глюкозы в крови после нагрузки достигает значительно больших величин и сохраняется значительно дольше.
Цель работы
Познакомиться с методикой проведения теста, построить «сахарные кривые» по предложенным данным и самостоятельно их проанализировать.
Выполнение работы
Предварительно у взрослого пациента определяют содержание глюкозы в крови натощак. Затем он принимает внутрь 75 г глюкозы, растворенной в 250-300 мл воды. Через 30, 60, 90, 120 и 150 мин после приема глюкозы определяют ее содержание в крови, и полученные результаты изображают в виде кривой, где на оси абсцисс откладывают время взятия крови в минутах, а на оси ординат – количество глюкозы, выраженные в ммоль/л. Такие графики традиционно называют «сахарными кривыми»:
На основании приведенных ниже данных (см. таблицу) предлагается построить «сахарные кривые», сравнить их между собой и сделать вывод об инсулиновом статусе пациентов (А, Б и В).
Согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) концентрация глюкозы 7,8 – 10,0 ммоль.л-1 в капиллярной цельной крови через 2 часа после нагрузки глюкозой свидетельствует о нарушении толерантности к глюкозе, а выше 11,1 ммоль.л-1 – о сахарном диабете.
Время взятия крови после приема глюкозы (мин) |
Количество глюкозы, ммоль.л-1 |
||
Пациент А |
Пациент Б |
Пациент В |
|
0 |
5,9 |
4,5 |
8,0 |
30 |
7,0 |
7,0 |
11,5 |
60 |
9,2 |
7,5 |
11,8 |
90 |
9,0 |
5,5 |
11,5 |
120 |
8,0 |
5,5 |
11,0 |
150 |
7,0 |
5,0 |
11,0 |
Выводы
Тестовые задания по теме:
«Распад и синтез гликогена. Гликолиз и гликогенолиз»
1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»
Скорость гликолиза и гликогенолиза контролируется фосфофруктокиназой .
Синтез и распад гликогена в тканях происходят различными путями.
Инсулин активирует фосфорилазу "b".
Гликоген в мышцах рападается с образованием глюкозо-6-фосфата.
Положительный баланс гликогенолиза составляют 2 молекулы АТФ.
Процесс гликолиза обратим.
Необходимо ли фосфорилирование глюкозы для включения ее в обменные процессы?
Все ли ферментативные реакции гликолиза обратимы?
Сопровождается ли процесс анаэробного гликолиза накоплением НАДН(Н+)?
Относится ли пируваткиназа к классу гидролаз?
Расщепляет ли альдолаза фруктозо-1,6-бисфосфат?
Обратима ли лактатдегидрогеназная реакция?
2) Выбрать один правильный ответ:
В опыте с мышечной тканью изучали гликолиз в анаэробных условиях. Скорость гликолиза уменьшается при добавлении:
|
Метаболит гликолиза в эритроцитах, изменяющий сродство гемоглобина к кислороду:
|
3) Установить последовательность образования метаболитов гликолиза
1. 2. 3. 4. 5.
|
А. фруктозо-1,6-бисфосфат Б. глицеральдегид-3-фосфат В. фруктозо-6-фосфат Г. 1,3-бисфосфоглицерат Д. глюкозо-6-фосфат |