4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче

А. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ: 1.3.99.1) – единственный фермент цикла трикарбоновых кислот Кребса, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий (комплекс II). Коферментом СДГ служит ФАД, акцептирующий два атома водорода от молекулы сукцината и переносящий их непосредственно на коэнзим Q (убихинон) в дыхательной цепи митохондрий. ФАД прочно связан с молекулой СДГ.

Цель работы

Убедиться в способности сукцинатдегидрогеназы мышечной ткани проявлять активность в анаэробных условиях.

Принцип метода

Доказательством проявления активности СДГ может служить изменение окраски искусственного акцептора водорода метиленового синего:

Выполнение работы

Так как восстановленная форма метиленового синего вновь окисляется на воздухе, опыт проводят в анаэробных условиях, предотвращая доступ кислорода наслаиванием на поверхность пробы вазелинового масла. Контролем служит гомогенат мышц, в котором СДГ инактивирована кипячением. Критерием активности СДГ служит время обесцвечивания опытной пробы в присутствии сукцината в анаэробных условиях.

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Гомогенат мышц (мясной фарш), мл	2	2
Нагревают при 100°С в течение 5 минут на водяной бане, а затем охлаждают до комнатной температуры	—	+
0,05 М Фосфатный буфер, рН 6,8, мл	1	1
5 мМ Сукцинат, мл	2	2
Метиленовый синий, 0,05% раствор, капли	2	2
Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой, заливают вазелиновым маслом и инкубируют при комнатной температуре
Окраска
Время обесцвечивания

Выводы

Б. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче

ПВК является промежуточным продуктом распада углеводов в организме. Она содержится во всех органах и тканях.

Клинико-диагностическое значение

Содержание ПВК в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы, токсикозах, при введении некоторых лекарственных средств, а также при недостаточности тиамина.

Цель работы

Определить количество пировиноградной кислоты и сравнить полученные результаты с нормой.

Принцип метода

Пировиноградная кислота, взаимодействуя с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФ-гидразин), в щелочной среде образует 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.

Реакция протекает по уравнению:

ПВК

2,4-ДНФ-гидразин

2,4-ДНФ-гидразон пировиноградной кислоты

Выполнение работы

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Моча, мл	1	—
H2O, мл	—	1
Спиртовой раствор КОН (2,5%), мл	1	1
Перемешивают в течение 1 минуты
2,4-ДНФГ (0,1% раствор в 2 М НС1, мл	0,5	0,5
Инкубируют 15 мин при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О ( = 490 нм, толщина кюветы 0,5 см). D490
Dоп - Dк

Строят калибровочный график зависимости D₄₉₀ от содержания ПВК.

Данные для построения калибровочного графика

ПВК, мкг	Dоп - Dк
5 10 20 30 40 50	0,08 0,14 0,29 0,45 0,60 0,78

Расчет содержания ПВК в суточной моче (на диурез 1500 мл):

= мг/сутки

Для пересчета содержания ПВК (в мг) в единицы количества вещества (мкмоль) надо умножить соответствующие величины на 11,4 (коэффициент пересчета).

Норма: 10-25 мг/сутки или 114-284 мкмоль/сутки пировиноградной кислоты.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Аэробный обмен углеводов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Скорость ЦТК регулируется аллостерическими ферментами - цитратсинтазой и изоцитрадегидрогеназой.

2. Положительный баланс ЦТК составляют 15 молекул АТФ.

3. Сукцинил-КоА является макроэргическим соединением.

4. В окислительном декарбоксилировании пировиноградной и -кетоглутаровой кислот участвует КоА.

5. Доля окисления пирувата в общем энергообмене организма незначительна.

6. Все ферменты ЦТК находятся в митохондриях.

7. Зависит ли скорость цикла трикарбоновых кислот от концентрации АТФ в клетке?

8. Катализирует ли сукцинатдегидрогеназа окисление янтарной кислоты?

9. Происходит ли в ЦТК субстратное фосфорилирование?

10. Все ли атомы глюкозы окисляются в ЦТК до СО₂?

11. Образуется ли НАДФН(Н⁺)в цикле трикарбоновых кислот?

12. Может ли цитрат из митохондрий попадать в цитоплазму?

2) Выбрать один правильный ответ

В цикле трикарбоновых кислот не участвует фермент: аконитаза транскетолаза сукцинатдегидрогеназа фумараза малатдегидрогеназа

В отсутствие окислительного фосфорилирования выход АТФ в ЦТК составляет (число молекул на 1 оборот цикла): 0 1 2 3 12

3) Найти соответствие процесса и регуляторного фермента, участвующего в нём

А. гликолиз Б. ЦТК

1. пируваткиназа 2. цитратсинтаза 3. фосфофруктокиназа 4. α-кетоглутаратдегидрогеназа 5. гексокиназа

Тестовые задания по теме: «Пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Нарушения обмена углеводов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы является поставщиком НАДФН(Н⁺) для восстановительных синтезов.

2. Передозировка инсулина вызывает у больного сахарным диабетом гипогликемию.

3. Фруктозо-6-фосфат - аллостерический регулятор гликолиза.

4. Рибоза должна поступать в организм с пищей.

5. Все ферменты гликолиза и пентозофосфатного пути находятся в цитоплазме.

6. При полном окислении одной молекулы глюкозы максимально может образоваться 38 молекул АТФ.

7. Является ли нормой содержание глюкозы в цельной крови 3,3 - 5,5 мкмоль/л ?

8. Связана ли болезнь Гирке (гликогеноз I типа) с наследственным дефектом синтеза глюкозо-6-фосфатазы в печени?

9. Содержится ли сахароза в крови?

10. Является ли галактоземия наследственным заболеванием?

11. Может ли пентозофосфатный путь окисления глюкозы давать энергию?

12. Является ли НАД⁺ коферментом транскетолазы?

2) Выбрать один правильный ответ:

Какова основная функция пентозофосфатного пути в эритроцитах? образование НАДФН(Н^+) образование рибозо-5-фосфата расщепление пентозофосфатов синтез АТФ восстановление Н2О2 до двух молекул воды

Метаболитом пентозофосфатного пути превращения глюкозы не является: рибозо-5-фосфат ксилулозо-5-фосфат фруктозо-6-фосфат глицеральдегидфосфат глюкозо-1-фосфат

3) Найти соответствие процесса и субстрата, участвующего в нём

А. Гликолиз Б. Пентозофосфатный путь превращения глюкозы

1. фруктозо-1,6-бисфосфат 2. рибозо-5-фосфат 3. пируват 4. глицеральдегид-3-фосфат 5. рибулозо-5-фосфат

Итоговые тестовые задания по теме: «Химия и обмен углеводов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Пируваткарбоксилаза - один из ферментов глюконеогенеза.

2. Адреналин индуцирует синтез гликогенсинтазы.

3. Гликоген мышц может поставлять глюкозу в кровь.

4. Глюкокортикоиды индуцируют синтез ферментов глюконеогенеза.

5. Адреналин и глюкагон усиливают синтез гликогена в мышцах.

6. Глицерин может быть субстратом глюконеогенеза.

7. Может ли наблюдаться гипергликемия при опухолях коры надпочечников?

8. Образуется ли молочная кислота в тканях мозга?

9. Присутствует ли глюкокиназа в мышечных клетках?

10. Является ли фосфофруктокиназа аллостерическим ферментом?

11. Происходит ли гликолиз в эритроцитах?

12. Связана ли галактоземия новорожденных с недостатком гексозо-1-фосфатуридинтрансферазы?

2) Выбрать один правильный ответ

Лактат, поступающий в кровоток, может снова превращаться в глюкозу в: печени сердечной мышце эритроцитах жировой ткани мозге

Непереносимость молока связана с недостатком фермента: амилазы альдолазы лактазы енолазы глюкокиназы

3) Найти соответствие процесса и субстрата, участвующего в нём

А. Гликолиз Б. Глюконеогенез

1. оксалоацетат 2. малат 3. лактат 4. 2-фосфоглицерат 5. пируват