Глава 6. Общая вирусология.

Общая характеристика вирусов, морфология и структура вирионов.

Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии яв­ляется русский ученый Дмитрий Иванович Ивановский, открывший и описавший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ).

Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделе­ны в особое царство - царство Vira.

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых существ:

1)наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза бел­ков;

2)отсутствие белоксинтезирующих систем и клеточного строе­ния;

3)внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне.

Внеклеточная форма вируса - вирион и вирус, находящийся внутри клетки хозяина - это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 наномет­ров. Нанометр - это 10^-9 метра (Рис. 6).

Наиболее мелкие вирусы - вирусы полиомиелита - имеют разме­ры 17-25 нм, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 нм.

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кислота - ДНК или РНК, однонитевая или двунитевая. Плюс-однони­тевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, например у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, нап­ример, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белко­вые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - ко­робка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уло­жены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда капсомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэд­ра).

Вирусы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, сос­тавляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У сложноорганизованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углево­ды, липиды, компоненты клетки хозяина.

Вследствие малых размеров вирусы не видны в световом мик­роскопе. Только наиболее крупный из них - вирус оспы - можно наблюдать в виде мелких точечных образований - элементарных те­лец Пашена.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы ос­пы, бешенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их можно обнаружить в световом микроскопе или в люминесцентном микроскопе. Обнаружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Негри в нервных клетках об­наруживаются при бешенстве.

Морфологию вирусов изучают в электронном микроскопе. Вирусы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

По типу нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусах, их де­лят на два подцарства: рибовирусы и дезоксирибовирусы, далее по структуре вирионов, по месту размножения и по другим признакам проводится деление на семейства и роды.

Репродукция вирусов

Вирусы не способны размножаться на питательных средах, это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от рик­кетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не разм­ножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раз­дельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному гено­му, его НК.

Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз (Рис.7 ):

- Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному вирусу.

- Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина.

- Третья фаза - "раздевание" вирионов, освобождение нуклеи­новой кислоты вируса от суперкапсида и капсида.

- Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирусспецифический белок.

- Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.

- Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.

Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.

Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеино­вая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так назы­ваемого провируса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-со­держащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транс­криптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный ге­ном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэ­тому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осу­ществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегра­тивными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.

Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфек­ционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у живот­ных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфель­да-Якоба, куру, скрепи и другие.

Методы культивирования вирусов

Вирусы - строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках. Для культивирования вирусов используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Кок­саки), кролики (вирус бешенства). Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков забо­левания и изменений органов животного.

Куриные эмбрионы 5-19-дневной инкубации пригодны для куль­тивирования большинства вирусов. Преимущества метода: стериль-

ность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность полу­чения вирусов в больших количествах, простота техники работы. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хори­он-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный ме­шок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по харак­теру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В алланто­исной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты.

Культура клеток - это клетки из органа животного или чело­века, которые живут и размножаются вне организма в питательном растворе (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре клеток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Различают несколько типов культур.

1)Первично-трипсинизированные, которые получают, обрабаты­вая трипсином исходную ткань, например, почки обезьян, или эмб­риональную ткань человека. Культура клеток используется однок­ратно.

2)Перевиваемые культуры клеток способны размножаться при многократных посевах на свежие питательные среды. Они могут под­держиваться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет. Во многих лабораториях применяются перевиваемые культуры, полученные из раковой ткани человека: HeLa HEp-2.

3)Полуперевиваемые культуры клеток - это, например, дипло­идные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размножаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя ис­ходный диплоидный набор хромосом.

Обнаружение вирусов в культуре клеток. Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вызывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД прояв­ляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании многоядерных клеток.

ЦПД можно обнаружить по цветной пробе. Для этого используют клетки, помещенные в питательную среду с индикатором, например, метиловым красным. При размножении незараженных клеток образуют­ся кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет на жел­тый. Если клетки заражены вирусом, происходит нарушение нормаль-

ного метаболизма клеток, и цвет среды не меняется.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить по образованию внутриклеточных включений.

Для подсчета количества вирионов используют метод бляшек. Клеточный монослой, покрытый тонким слоем агара, в плоском фла­коне, заражают вирусом и по количеству бляшек или "стерильных пятен" подсчитывают количество вирионов. Считается, что одна бляшка образуется при размножении одного вириона.

Репродукцию вируса в клетке можно обнаружить по реакции ге­мадсорбции. Это вариант реакции гемагглютинации. Эритроциты, внесенные в культуру клеток, адсорбируются на поверхности кле­ток, зараженных вирусом. Реакцию применяют, например, для обна­ружения вируса гриппа.